丝瓜叶提取物凝胶剂的制备及生物活性研究

陈霓平，蔡浛，陈泽丰，卞旺青，王亚坤，张紫菱，张焜，何燕

（广东工业大学生物医药学院，广东 广州 510006）

丝瓜叶为葫芦科丝瓜属植物丝瓜（Luffa cylinderi Roem）的叶，又名虞刺叶，出自《滇南本草》，《全国中草药汇编》、《中药大辞典》和《中华本草》中均有记载。《滇南本草》中记载“叶，晒干为末，治绞肠痧”[1]。《全国中草药汇编》记载，丝瓜叶味苦、酸，微寒，具有止血、清热解毒和化痰止咳等功效，内服用于百日咳，咳嗽，暑热口渴；外用治创伤出血，疥癣，天疱疮[2]。现代药理研究证实，丝瓜提取物在抗炎、增强机体免疫、脑缺血损伤、改善认知障碍等方面有一定的药理活性[3-6]。丝瓜叶中含有三萜皂苷、总黄酮、挥发油、酚类等活性成分[7-8]。日本已将丝瓜皂苷与绞股蓝皂苷合用，做成含人参皂苷且具有人参功能的食品应用于临床[9]。丝瓜叶中黄酮是一种很强的抗氧化剂，可有效阻止细胞的退化、衰老，也有较好的抑制酪氨酸酶活性，减少黑色素的生成[10]具有美白功效，是丝瓜叶的主要活性成分。

凝胶剂是经皮给药新剂型，具有涂抹性好、无油腻感、皮肤表面停留时间长、透皮吸收速度快、使用方便等优点[11]。目前市场上丝瓜叶的相关产品较少，为进一步开发和利用丝瓜叶资源，将丝瓜叶制备成凝胶剂，通过体外局部给药，以期达到抑菌、抗氧化等效果。本研究采用榨汁-喷雾干燥法获得丝瓜叶提取物，选取水性凝胶基质制备丝瓜叶外用凝胶，使丝瓜叶凝胶有良好的生物相容性，稳定性，并对其进行质量评价及活性研究，为丝瓜叶的进一步开发应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

丝瓜叶（食用级）：山东千草有限公司；芦丁对照品：北京万佳首化生物科技有限公司；卡波姆940（药用级）：广州美懿生物科技有限公司。以下试剂为分析纯，亚硝酸钠：天津市广成化学试剂厂；氢氧化钠（颗粒）：天津市鼎盛鑫化工有限公司；胰蛋白胨、酵母膏：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；PEG-40氢化蓖麻油、三乙醇胺、氯化钠：广州化学试剂厂；硝酸铝、氢氧化钠：天津市大茂化学试剂厂；枯草芽孢杆菌（B.cereus）、金黄色葡萄球菌（S.aureus）、大肠杆菌（E.coli）：广州微生物研究所。

1.2 仪器与设备

DZF-6090真空干燥箱、DZF-6090型恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；PE-Lambda25紫外可见分光光度计：美国铂金埃尔默公司；ADL311喷雾干燥器：重庆雅马拓科技有限公司；FE20 pH计：梅特勒-托利多仪器上海有限公司；Mk3酶标仪：芬兰雷勃公司；SN510C型立式压力蒸汽灭菌器：重庆雅马拓科技有限公司。

1.3 制备丝瓜叶凝胶

将新鲜丝瓜叶称重切碎榨汁得丝瓜叶糊，再将其煮沸，冷却过滤即得丝瓜叶原汁。丝瓜叶原汁加去离子水稀释，进行喷雾干燥，得到丝瓜叶提取物。喷雾干燥器相关参数：入口温度140℃、蠕动泵转速2档、风机转速4档、压力0.1 MPa。

根据配方精密称取卡波姆940于容器中，滴加甘油研磨至黏稠状，加入适量纯化水静置溶胀24 h，另取丝瓜叶粉用水溶解，与PEG-40氢化蓖麻油、尼泊金乙酯、丁二醇分别加入凝胶基质中，搅匀；滴加适量三乙醇胺至pH6.0～8.0，加水搅拌成型，即得丝瓜叶凝胶。凝胶配方见表1。

表1 凝胶配方Table 1 Gel formula

1.4 总黄酮含量测定

1.4.1 标准品溶液

精密称取10.0 mg芦丁标准品用60%乙醇溶解、定容配制成浓度为0.1 mg/mL的芦丁标准品溶液。

1.4.2 供试品溶液

称取10.0 g丝瓜叶凝胶（其中丝瓜叶粉质量分数为3%，即包含丝瓜叶粉0.3 g）用适量60%乙醇超声溶解、定容，得供试品丝瓜叶凝胶溶液，备用。

1.4.3 空白对照品溶液

按凝胶配方制备空白凝胶（不含丝瓜叶提取物），根据“1.4.2”项下方法制备得空白凝胶溶液。

1.4.4 最大吸收波长测定

取芦丁标准溶液、丝瓜叶凝胶溶液和空白凝胶溶液各1mL分别置于10 mL具塞试管中。加入4 mL 60%乙醇和1 mL 1∶9的Al（NO3）3现配溶液，摇匀，室温（25℃）下静置6 min（显色处理），用60%乙醇定容至10 mL静置10 min。以无水乙醇作空白溶液，在紫外可见分光光度计上扫描300 nm～700 nm波长，以确定最大吸收波长。

1.4.5 线性考察

精密吸取0.1 mg/mL的芦丁标准溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分别置于 10 mL 具塞试管中，显色处理，定容至10mL，于最大吸收波长处测定光密度（OD）值，也称为吸光度。以吸光度A对质量浓度C进行线性回归，得标准曲线。

1.4.6 精密度试验

精密量取6份供试品溶液1 mL，置于10 mL具塞试管中，显色处理后，在最大吸收波长最大吸收处测定OD值，计算相对偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.4.7 重复性试验

精密称取10 g同一批丝瓜叶凝胶共6份，按“1.4.2”项下方法配制供试品溶液，各取1.0 mL，置于10 mL具塞试管中，显色处理后，在最大吸收波长处测定OD值，计算RSD。

1.4.8 稳定性试验

将1 mL供试品溶液加入10 mL具塞试管中，经显色处理后，在最大吸收波长处每隔10 min测定一次OD值，共12次，计算RSD。

1.4.9 加样回收试验

精确量取6份供试品溶液1.0 mL，分别向其中滴加 0.1mg/mL 标准芦丁溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL，显色处理，在最大吸收波长处测定OD值，计算回收率。

1.4.10 含量测定

分别称取3批丝瓜叶凝胶各10 g，按照“1.4.2”项下方法，制备供试品溶液，显色处理后，在最大吸收波长处测定OD值，采用标准曲线法计算丝瓜叶凝胶溶液中总黄酮的含量。

1.5 稳定性评价

将样品进行高温试验、高湿试验、暴露于空气、离心试验试验，对丝瓜叶外用凝胶剂的稳定性进行考察，确保其质量可控与安全，符合中国药典的相关规定。

分别取3批10g丝瓜叶凝胶置于玻璃皿，进行10d的高温（60℃）、高湿[相对湿度（relative humidity，RH）为92.5%]、暴露空气影响因素试验，于0、5、10 d取样检测丝瓜叶凝胶的质量、外观性状、活性成分含量。取3批丝瓜叶凝胶10.0 g于3 000 r/min的转速下离心处理30 min，观察丝瓜叶凝胶形态及颜色变化，考察其性状稳定性。

1.6 pH值测定

取丝瓜叶凝胶约1.0 g于20 mL蒸馏水中溶解，用pH计测量其酸度，测量3次，计算平均值。

1.7 抑菌活性研究

1.7.1 液体培养基的制备

精密称取5 g/L酵母膏，10 g/L胰蛋白胨和10 g/L氯化钠，加热溶解，滴加适量NaOH溶液至pH值为7.4，过滤得到液体培养基，灭菌，备用。

1.7.2 倍比稀释法测定抗菌活性

选用枯草芽孢杆菌（B.cereus）、金黄色葡萄球菌（S.aureus）和大肠杆菌（E.coli），共 3 种供试菌种[12-14]。每种细菌取8支试管进行编号，第1支试管为阴性对照，其中只加入1 mL的液体培养基，第2支试管为阳性对照，加入0.5 mL液体培养基和0.5 mL双抗。第3支试管开始到第8支试管各加入1 mL液体培养基。取1 mL丝瓜叶凝胶溶液于第3支试管中，按照倍比稀释法，混匀后从第3支试管吸取1 mL液体，加入第4支试管中。重复操作至最后一支试管，将丝瓜叶凝胶溶液配制成浓度不同的溶液。每组试管各加入一定浓度的试验菌液0.1 mL。恒温培养24 h观察比较试管的浑浊程度，记录结果，重复3次试验。

1.8 抗氧化活性测定

1.8.1 清除ABTS+自由基能力测定

参照文献方法[15-16]，以维生素C（VC）作为阳性对照药物。精密称取0.040 6 g ABTS溶于水，定容到10 mL容量瓶中，同样操作配制过硫酸钾溶液。混合配好的两种溶液，放置于黑暗环境中14 h。取适量无水乙醇稀释至734 nm处的OD值为0.70±0.02，作为ABTS+自由基阳离子反应液。

配制浓度为 1.562 5、3.125、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL的丝瓜叶凝胶溶液和对照品VC溶液，分别取75 μL不同浓度的丝瓜叶凝胶溶液加入96孔板中，后加入 75 μL ABTS+自由基反应液，30℃反应 6 min，每组平行设置3组，以水为基准，使用酶标仪测定734 nm的吸光度，作为As。将各浓度提取物用水替代，测定734nm下的OD值，作为空白对照，记为Ac。平行测定3次，取平均值，按公式（1）计算ABTS+自由基清除率。VC按相同方法测ABTS+自由基清除率。

式中：As为丝瓜叶凝胶溶液的OD值；Ac为水的OD值（空白对照）。

1.8.2 清除DPPH自由基能力测试

参照文献方法[17-18]，精密配制25mL浓度为0.1mmol/L的DPPH自由基溶液。配制浓度为1.562 5、3.125、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL 的丝瓜叶凝胶溶液和对照品VC溶液，分别取各不同浓度丝瓜叶凝胶溶液250 μL以及DPPH溶液250 μL，混合摇匀后，室温（25℃）避光条件下反应30 min，以甲醇溶液为基准，平行设置3组，在517 nm处测定OD值记为Asample，取平均值；把待测丝瓜叶凝胶溶液换成纯化水，加入DPPH溶液，混合摇匀后测定OD值记为Acontrol，再把DPPH溶液换成甲醇溶液，加入各系列浓度的待测丝瓜叶凝胶溶液，摇匀，平行设置3组，同样方法测定OD值记为Asample blank，取平均值。以VC作阳性对照组，按公式（2）计算DPPH自由基清除率。

式中：Asample为加入DPPH溶液后待测溶液丝瓜叶凝胶溶液的OD值；Acontrol为加入DPPH溶液后水的OD值；Asampleblank为加入甲醇溶液后各系列浓度的待测丝瓜叶凝胶溶液的OD值。

1.9 酪氨酸酶抑制活性研究

参照吴颖等[19]的方法，将丝瓜叶凝胶配成含总黄酮浓度为0.5、1、2 mg/mL的溶液作为待测物。向96孔板中依次加入50 μL磷酸盐缓冲液（pH=6.8）、50 μL酪氨酸酶溶液和50μL无水乙醇，30℃恒温反应10min，后加入50 μL的0.5 mg/mL左旋多巴摇匀，放置30℃下反应5 min，用酶标仪在475 nm进行吸光度测定，作为A2；用待测物（各系列浓度的丝瓜叶凝胶溶液）50μL替代无水乙醇，按照上述方法测定吸光度，作为A1；分别按照上述方法对不加酶的待测液空白组和不含酪氨酸酶的溶剂空白组进行吸光度测定，作为A3和A4。以熊果苷作为阳性对照，将其配成与待测物相同的系列浓度，按照下述公式（3）进行酪氨酸酶抑制率测定[20-21]。

式中：A1为加入待测物的吸光度；A2为加入无水乙醇的吸光度；A3为不加酶的待测液空白组的吸光度；A4为不含酪氨酸酶的溶剂空白组的吸光度。

2 结果与分析

2.1 丝瓜叶提取物的制备

50.0 g丝瓜叶经榨汁、喷雾干燥得到浅绿色细粉末，喷雾干燥得率为22.79%。丝瓜叶外用凝胶剂成品为深绿色透明半固体物质。

2.2 总黄酮含量测定

2.2.1 最大吸收试验

取芦丁标准溶液、丝瓜叶凝胶溶液和空白凝胶溶液，在紫外可见分光光度计上扫描300 nm～700 nm波长。结果芦丁在410 nm处有最大吸收峰，以确定在此范围内的最大吸收波长为410 nm，空白凝胶在此波长处无吸收，辅料无干扰。

2.2.2 芦丁标准曲线的绘制

将显色处理后的芦丁标准分别于取上清液于410nm处测定OD值。以吸光度A对质量浓度C进行线性回归，芦丁标准曲线见图1。

如图1所示，得标准曲线y=26.357 14x-0.008 36（R=0.999 74），可见芦丁在 5 μg/mL～30 μg/mL 的浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系，可精确测定丝瓜叶外用凝胶中黄酮的相对含量。

图1 芦丁标准曲线Fig.1 Rutin standard curve

2.2.3 精密度试验

丝瓜叶凝胶溶液的吸光度基本一致，吸光度平均值0.434（RSD=0.58%），试验方法的精密度好。

2.2.4 重复性试验

6份丝瓜叶凝胶溶液的吸光度基本一致，吸光度平均值0.434（RSD=0.81%），相对标准偏差小，试验重复性良好。

2.2.5 稳定性试验

丝瓜叶凝胶溶液在120 min内吸光度基本一致，吸光度平均值0.432（RSD=0.52%），丝瓜叶凝胶溶液在2h内稳定性较好。

2.2.6 回收率试验

丝瓜叶外用凝胶回收率试验结果见表2。

表2 丝瓜叶外用凝胶回收率试验结果（n=6）Table2 Recovery results of external gelatin for loofah leaves（n=6）

如表2所示，平均回收率为99.09%，RSD=0.70%，符合分析要求，方法准确度高。

2.2.7 含量测定

配制3批凝胶剂溶液，测定总黄酮的含量，丝瓜叶粉中总黄酮含量测定结果见表3。

结果如表3所示，丝瓜叶粉中总黄酮含量为（0.57±0.02）%，即（5.7±0.2）mg/g，含量较高。黄酮具有很好的抗菌抗氧化抑制络氨酸酶活性的功能，可以有效杀灭有害细菌，清除人体内自由基且具美白功效。

表3 丝瓜叶粉中总黄酮含量测定结果Table 3 Determination results of total flavonoids in loofah leaves powder

2.3 稳定性评价

丝瓜叶外用凝胶经过高温、高湿、暴露空气10 d，其质量、外观性状、活性成分含量均无显著变化。离心处理后所制备的凝胶未出现分层、变粗和沉淀等现象。丝瓜叶凝胶在极限的条件下无大的性质变化，稳定性好，符合要求。

2.4 pH值测定

丝瓜叶外用凝胶平均pH值为7.47，不会刺激给药部位，符合中国药典要求，可安全使用。

2.5 抑菌活性研究

丝瓜叶凝胶剂对3种菌株的抑制效果如表4所示。

表4 丝瓜叶外用凝胶对3种菌株的最低抑菌浓度Table 4 Minimum inhibitory concentration（MIC）of loofah leaves external gel on 3 strains

由试验结果知，丝瓜叶凝胶剂的抑菌效果金黄色葡萄球菌>枯草芽孢杆菌>大肠杆菌，主要由于丝瓜叶凝胶对革兰氏阳性菌敏感，因此对金黄色葡萄球菌抑制效果明显。枯草芽孢杆菌最低抑菌浓度为640 μg/mL丝瓜叶凝胶对枯草芽孢杆菌抑制作用较小，对大肠杆菌无抑菌效果。因此，丝瓜叶凝胶剂有一定的抑菌效果。

2.6 抗氧化活性测定

ABTS+自由基和DPPH自由基清除率试验见图2。

清除ABTS+自由基能力测定结果如图2A所示，丝瓜叶凝胶剂对ABTS+自由基清除效果明显，与阳性对照VC相近，且清除率随着抗氧化剂浓度的增大而增大，其半抑制浓度（50% inhibiting concentration，IC50）为20.12μg/mL，具有较强的清除ABTS+自由基抗氧化活性。

图2 丝瓜叶外用凝胶在不同浓度条件下ABTS+自由基清除率和DPPH自由基清除率Fig.2 ABTS+free radical scavenging rate and DPPH free radical scavenging rate of loofah leaves external gel under different concentration conditions

清除DPPH自由基能力测定结果如图2B所示，测得其IC50为46.80 μg/mL。清除率随着抗氧化剂浓度的增大而增大，当浓度超过46.80 μg/mL后其清除率增加迟缓，不及阳性对照物VC。丝瓜叶凝胶具有一定的清除DPPH自由基抗氧化活性。

2.7 酪氨酸酶抑制活性研究

酪氨酸酶抑制试验结果如图3所示。

图3 酪氨酸酶抑制试验结果Fig.3 Results of tyrosinase inhibition experiment

如图3所示，丝瓜叶凝胶对酪氨酸酶抑制效果明显，接近阳性对照组熊果苷，且随着丝瓜叶凝胶浓度的增大而增大，当浓度达到2 mg/mL时其抑制效果可达到45.09%。因此，丝瓜叶凝胶可有效抑制酪氨酸酶活性，减少黑色素的生成，具有美白的功效。

3 结论与讨论

本研究采用榨汁提取-喷雾干燥法得到浅绿色丝瓜叶提取物粉末，以卡波姆940为主要基质制备丝瓜叶凝胶。研究建立了紫外-可见分光光度法测定总黄酮含量，方法学研究表明本法具有良好的线性、稳定性、精密度、重复性和回收率，可用于丝瓜叶凝胶中黄酮活性成分的测定。活性研究结果表明，丝瓜叶凝胶剂具有良好的抑菌、抗氧化、酪氨酸酶抑制活性。丝瓜叶外用凝胶剂对金黄色葡萄球菌抑制效果明显，对ABTS+自由基及DPPH自由基均有较好的清除抗氧化效果，对酪氨酸酶具有明显的抑制作用，其抑制效果与熊果苷相当。研究制得质地细腻、黏度适宜、涂展性好、高温稳定的亲水性丝瓜叶凝胶，质量稳定可控，具有一定生物活性。较丝瓜叶片[22]、丝瓜叶固体饮料[23]、丝瓜叶膏有更好的应用价值[24]，为丝瓜叶的进一步开发提供参考依据。