基于新型标记材料的免疫分析技术在真菌毒素检测中应用的研究进展

胡高爽，吴天琪，苏 丹，高娟娟，陈永媛，韩 雪，郝建雄，李 娜，郭 峰，高 山,

（1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄 050000；2.河北英茂生物科技有限公司，河北石家庄 050000；3.河北省食品质量与安全检测技术创新中心，河北石家庄 051130）

真菌毒素（Mycotoxin）是由真菌产生的次级代谢产物，按化学结构来分，目前已知的真菌毒素有300 多种，其中具有代表性的有黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮毒素、伏马毒素、赭曲霉毒素、呕吐毒素等。真菌毒素不仅能够导致食品腐败变质、品质降低，而且给人类和动物带来严重的健康风险，增加自身细胞出现癌变、畸形、突变的风险[1−2]。因此针对其开发简单快速、灵敏可靠的检测方法，具有重要的研究价值和现实意义。真菌毒素的检测方法有很多种，其中，仪器分析法，包括液相色谱法（Liquid chromatography,LC）[3]、液相色谱法与质谱联用方法（LC-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[4−5]、气相色谱与质谱联用法[6−7]等，因具有灵敏度高、测定结果准确可靠是目前最常用的真菌毒素检测方法，但由于其需要使用大量的有机溶剂，需要昂贵的精密仪器，检测成本高，检测步骤冗长繁琐且需要专业的操作人员，因而在现场快速筛查中的应用受到很大的限制。

免疫分析方法是一种基于抗体与抗原的特异性结合反应，是生物分析的重要手段之一，具有操作简单、特异性好、灵敏度高等优点[8−9]，非常适合于大量样品的现场快速检测和筛选，在真菌毒素的快速检测中应用广泛。近年来，随着纳米科学的发展，一些新型标记材料的出现促进了免疫分析技术的进一步发展，本文针对基于新型标记材料的免疫分析技术应用于粮食产品中真菌毒素快速检测的研究现状进行综述，以期为免疫分析技术在真菌毒素检测的应用及发展提供参考。

1 酶联免疫吸附法在真菌毒素检测中的应用

酶联免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是利用固相载体上的抗原（或抗体）能够与待测样品的抗原（或抗体）特异性结合，洗涤除去未与固相结合的其他物质，再加入能够与抗原抗体结合的酶，此时待测物的量与固相上酶的量呈一定比例，最后加入底物，在酶催化的作用下底物颜色发生改变，通过测定底物的吸光度反映待测物量的多少，最终实现对目标物定性定量分析。Michalina 等[10]利用ELISA 方法实现了花生中黄曲霉毒素B1和总黄曲霉毒素的快速检测，其针对黄曲霉毒素B1和总黄曲霉毒素的检测限分别能够达到0.4 μg/kg 和0.3 μg/kg。Zhang 等[11]建立了测定谷物中赭曲霉毒素A 含量的间接竞争ELISA 方法，检测限能够达到0.15 ng/mL，线性范围为0.55～6.75 ng/mL。ELISA方法利用抗原抗体的特异性结合反应，具有灵敏好、特异性强等特点，但由于其采用酶蛋白作为标记物，需要复杂的样品前处理步骤消除样品中物质的干扰，因此，目前在真菌毒素检测中的应用受到一定的限制，寻找抗基质干扰能力强的信号标记物成为目前酶联免疫吸附法发展的趋势。

近年来一些新型的纳米标记材料越来越多的引起关注，越来越多的应用于真菌毒素的检测中。Zhang 等[12]将碲化镉量子点与黄曲霉毒素B1的单克隆抗体偶联，建立了直接竞争荧光免疫吸附法（FLISA），该方法的检测限为0.016 ng/mL，花生基质中样品回收率能够达到85%～117% 。Wu 等[13]以包被原修饰的磁性纳米颗粒（MNPs）作为免疫传感探针，以多色上转换纳米粒子（UCNPs）修饰的抗体作为荧光信号探针，建立了能够测定玉米中黄曲霉毒素B1（AFB1）和赭曲霉毒素 A（ochratoxin A，OTA）2 种毒素的新型 FLISA。这种方法利用 UCNPs 多组分检测的特性和 MNPs 的磁性分离效应，表现出灵敏度高（OTA 的检测限均低至 0.01 μg/kg），检测时间短等优点，可用于复杂基质中真菌毒素的快速检测。Hu 等[14]利用发射波长为474 nm 的上转换纳米粒子，构建了磺胺喹恶啉上转换标记-磁分离荧光免疫分析方法。该方法对磺胺喹恶啉的方法检出限为0.1 μg/L，添加回收实验得到磺胺喹恶啉的回收率良好，在69.8%～133.0%之间，且与商业化ELISA 试剂盒相比较，测定结果具有很好的一致性。

2 免疫层析技术在真菌毒素检测中的应用

免疫层析方法是通过将特异性的抗原（或抗体）固定在硝酸纤维素膜等载体的某一区带上，当样品和标记探针混合物在层析作用下在膜上移动并流经该区带时，样品中相应的抗体（或抗原）与膜上对应的抗原（或抗体）发生特异性结合并富集，并在该区带上显示出探针标记物的信号，进而实现对目标物的定性定量分析。该技术由于操作步骤简单、快速，成本低，在疾病快速诊断、食品安全检测、环境污染监测等领域得到了广泛的应用。

2.1 胶体金免疫层析技术

胶体金作为标记材料具有检测结果可视化、制作简单等优点，在免疫层析技术中应用广泛。Hou 等[15]构建了基于25 nm 胶体金的复合免疫层析分析方法，并实现同时对小麦和玉米样品中伏马毒素B1（FB1）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）和玉米赤霉烯酮（ZEN）进行定性半定量检测。在最优条件下，免疫层析试纸对FB1、DON 和ZEN 的可视化定量限分别为60、12.5 和6 ng/mL。然而胶体金作为信号标记材料具有成本高、易受环境污染、易受样品基质干扰等缺点，因此在真菌毒素检测中应用受到限制。

2.2 基于功能性纳米粒子的免疫层析技术

近年来一些基于新型纳米粒子的免疫层析技术受到越来越多的关注。纳米粒子一般是指尺寸在1～100 nm 的超微粒子，具有比表面积大、表面稳定性高等特点。将其作为标记物代替传统胶体金，可显著提升现有免疫层析分析方法的灵敏度和稳定性。

2.2.1 基于纳米微球的免疫层析技术 纳米微球免疫层析技术是利用微球表面修饰羧基，进而可共价结合抗体，同时利用其稳定而强的颜色信号或荧光信号进行定量检测的新型检测技术。Liu 等[16]利用荧光微球作为信号探针并应用于免疫层析技术中实现酱油中黄曲霉毒素B1的快速检测。该方法针对黄曲霉毒素B1的可视检出限为2.5 μg/L，低于中国政府规定的最高5 μg/L。并且测定的结果与液相.色谱-质谱法（LC-MS）的结果一致。Zhang 等[17]建立了基于荧光微球的免疫层析技术，并成功应用于牛奶中黄曲霉毒素M1的快速检测。在最佳条件下，该方法的IC50值为36.3 ng/L，样品回收率为76.6%～110.8%，变异系数为4%～14.7%。结果表明，应用该方法检测牛奶中AFM1残留具有简便、快速、灵敏度高、特异性强的特点。Li 等[18]构建了基于乳胶微球的免疫层析技术，并研制了基于智能手机的定量检测装置，最终实现了谷物和饲料中玉米赤霉烯酮（ZEN）的现场检测，利用该系统针对谷物和饲料中ZEN 的检测限分别为0.08 和0.18 μg/kg，该方法表现出稳定性好、灵敏度高、检测方便快捷等优点，非常适合现场快速检测。

2.2.2 基于量子点的免疫层析技术 量子点（Quantum dots，QDs）粒径一般介于1～10 nm 之间，是一类由Ⅱ-Ⅵ族（如CdSe，CdTe，CdS，ZnSe 等）或Ⅲ-Ⅴ族（如InP，InAs 等）元素组成的纳米颗粒。与传统的荧光染料相比，它具有宽的紫外激发光谱和狭窄对称的荧光发射光谱，量子产率高，光化学稳定性强，荧光寿命长，可接受多次激发等优越的荧光特性，因此，可以很好地应用于荧光标记。Hu 等[19−20]利用量子点与胶体金存在荧光淬灭的现象，构建了基于量子点的信号turn-on 模式的荧光猝灭免疫层析检测方法，并成功应用于动物源性食品中喹诺酮和磺胺类兽药的快速检测。该设计方法操作简便，检测时间短，灵敏度高，可以为兽药残留快速检测提供新思路。Hou 等[21]构建了基于量子点标记的荧光免疫层析法，并实现了谷物中的伏马毒素B1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）和玉米赤霉烯酮（ZEN）同时定量检测，针对FB1、DON 和ZEN 的IC50值分别为12.66、2.97、0.87 ng/mL。在构建针对小分子的免疫层析技术的过程中，直接标记抗体可能会影响抗体与靶抗原的结合性能。此外，化学合成半抗原偶联物，特别是毒性半抗原，可能面临操作复杂、批次间误差大、环境污染等问题。Hu 等[22]利用量子点标记的链球菌蛋白G 作为通用荧光探针和生物合成模拟肽MBP 融合蛋白（F15-MBP）作为生物毒素包被原的替代物构建免疫层析方法，改善了以生物毒素直接制备半抗原存在污染环境、操作复杂等缺点，并实现了伏马毒素B1的快速检测，该方法表现出检测灵敏度高，毒性小，环境友好等特点，可以作为真菌毒素检测的有效方法。

2.2.3 基于普鲁士蓝纳米粒子的免疫层析技术 普鲁士蓝（Prussian blue，PB）是一种古老的蓝色染料，由 Fe2+和 Fe3+混合价态组合成的六氰合铁酸盐，其制备工艺简单成本低，表面易修饰，且具有良好的光物理、电化学、电质变色和磁性等特点被应用于诸多领域。近年来，其在食品安全检测方面的应用逐渐增多。Zhao 等[23]利用普鲁士蓝纳米粒子作为标记材料构建了针对克仑特罗快速检测的免疫层析试纸条，该方法针对克伦特罗的检测灵敏度为1.0 ng/mL，是传统胶体金免疫层析技术的5 倍。Tian 等[24]利用普鲁士蓝纳米粒子介导信号的产生和级联放大灵敏的免疫层析方法，并实现了针对赭曲霉毒素A（OTA）的快速检测。当OTA 浓度为10 ng/mL 时，试纸条T 线上的颜色完全消失。普鲁士蓝作为一种新型的纳米粒子在免疫层析技术中的应用有待进一步研究和开发。

2.2.4 基于上转换纳米粒子的免疫层析技术 上转换纳米粒子（UCNPs）是指受到光激发时能够通过多光子机制发射比激发波长短的荧光纳米材料[25−26]，其基本组成包括基质材料、激活剂和敏化剂，相较于传统的有机染料作为生物标记材料，具有如下诸多优点[27,28]：光化学性质稳定性高；长波长激发短波长发射，背景干扰小，特别适合复杂生物样本中的荧光标记。黄震等[29]利用上转换纳米材料，构建了牛奶中大肠杆菌O157:H7 的快速检测的免疫层析方法，方法检测限能够达到2.8×104CFU/mL。该方法灵敏度较高，抗基质干扰能力强，不仅能用于大肠杆菌O157:H7 的检测，也可被推广应用于其它食源性致病菌检测。Gong 等[30]开发了一个小型化、便携化的基于上转换纳米粒子的免疫层析检测（LFA）平台，该平台由免疫层析检测系统、UCNP-LFA 读数和智能手机辅助的UCNP-LFA 分析仪组成。LFA 检测系统由三种发射波长UCNPs 构成，可以进行多路检测。UCNP-LFA 读数长宽高为24.0 cm×9.4 cm×5.4 cm（L×W×H）和重量为0.9 kg。该分析仪基于智能手机定制设计的软件（称为UCNP-LFA 分析仪），可以实时得到定量分析结果。通过对小分子赭曲霉毒素A（OTA)、重金属离子（Hg2+）、细菌（沙门氏菌，SE）、核酸（乙肝病毒，HBV）和蛋白（生长刺激表达基因2，ST-2）的高灵敏度定量检测，证明了该平台的通用性。

2.2.5 基于磁性纳米粒子的免疫层析技术 磁性纳米粒子主要由磁性元素包括Fe，Ni，Co 以及它们的氧化物组成，具有比表面积大，可快速移动及生物相容性、超顺磁性、单分散性好等特性，在磁场作用下可实现快速定位富集和分离[31]。Tang 等[32]以纳米Fe2O3颗粒为核，金标纳米颗粒为壳，制备了磁纳米金微球（MnGMs），并构建了一种快速检测食物中黄曲霉毒素 B2（AFB2）的免疫层析检测方法。该方法针对AFB2检出限为0.9 ng/mL，比传统胶体金免疫层析试纸条灵敏度提高3 倍。Huang 等[33]利用纳米磁珠富集和分离 AFM1，建立了快速检测 AFM1的免疫层析方法，该方法针对牛奶中AFM1检出限为0.1 ng/mL，且检测结果和酶联免疫吸附法检测结果相一致，说明该方法非常适合牛奶中AFM1的快速检测。刘坤等[34]采用聚乙烯亚胺-戊二醛介导体系制备了ZEN 免疫磁性微球，建立了高效富集捕获饲料样本中ZEN 的方法。结果表明该试纸条定量检测时间为15 min，最低灵敏度为2.559 μg/L，且与ELISA 试剂盒有很好的相关性。此外，张博等[35]利用超声乳化法成功制备多包裹磁纳米球，将其作为信号标记物，构建了基于磁致荧光淬灭的双模态联检免疫层析试纸条，并实现对血清及全血中生物标志物的高灵敏双模态联合检测。结果表明，多包裹磁球荧光淬灭能力强，稳定性好，在对乳腺癌相关标志物CA153 和CEA 的联合检测中，灵敏度分别可达到0.06 ng/mL 和0.09 U/mL，该联检技术的应用能够提高肿瘤和急性病症的检出率，降低成本和样本用量，缩短检测时间。目前，基于磁性纳米粒子的免疫层析技术作为新兴的标记层析技术已经引起了研究者的广泛关注，是未来较好的研究方向。

3 电化学免疫传感器在真菌毒素检测中的应用

电化学免疫传感器是一种结合电化学测定和免疫反应反应的分析器件，具有分析速度快、灵敏度高、特异性好、所需样品量少、操作简单、易于微型化等优点，在临床诊断、食品分析及环境监测等领域具有重要的应用价值。Hou 等[36]开发一种超灵敏和绿色的检测赭曲霉毒素A（OTA）的电化学免疫传感器方法。该方法以OTA 噬菌体模拟肽代替传统化学合成的竞争抗原，应用与竞争感应平台上进行检测。并用聚乙二醇（PEG）修饰工作电极固定化抗体。在优化的试验条件下，建立的免疫传感器的检出限（LOD）为2.04×10−14g/mL，线性范围为7.17×10−14～5.49×10−12g/mL。Enrique 等[37]构建了一种用于食品样品中霉菌毒素残留检测的电化学免疫传感器。该装置使用电化学纳米探针（CdSNP-AbDON）和抗原修饰的磁粒子（DON-BSAMP）检测霉菌毒素，在小麦的检测限量（LOD,IC90）为342.4 μg/L，低于欧盟规定的该霉菌毒素的最大残留限量（MRL，未加工的硬粒小麦为1750 μg/L，直接供人类食用的谷物为750 μg/L）。Paniel 等[38]开发了一种基于磁性纳米颗粒的电化学免疫传感器并用于检测牛奶中微量的黄曲霉毒素M1（AFM1）。该传感器的样品检测限低至0.01 μg/L，且具有良好的重现性。

4 免疫芯片技术在真菌毒素检测中的应用

免疫芯片技术是近年发展应用的一种高新技术。人工制成抗原或抗体与芯片结合，再将芯片与样品一同反应，将反应信号数据实时上传，从而实现定量检测。免疫芯片准确度高，灵敏度好，过程全自动，但技术尚不成熟，仍需发展。Chen 等[39]基于微流体技术和蛋白芯片技术，建立了一套快速、灵敏的真菌毒素免疫检测系统。利用一个定制包含流体控制系统和成像系统的微型装置可以实现在30 min 内检测四种真菌毒素的目的，表现出样品用来体积小并且对用户友好的特点。蔡婷婷等[40]利用多孔硅比表面积大，结合位点多的特点，以多孔硅为载体，结合免疫分析技术，建立一种蛋白质芯片技术来检测谷物中的多元真菌毒素。方法对OTA 的检测限为 32.6 pg/mL，AFB1的检测限为0.314 ng/mL，FB1的检测限为0.197 ng/mL。Li 等[41]提出了一种基于纳米银的可视化免疫微阵列方法，应用该方法可实现牛奶中的三聚氰胺、头孢氨苄和黄曲霉毒素M1等多种靶标的同时检测，其针对黄曲霉毒素M1的检出限能够达到0.21 ng/mL。

5 基于免疫分析的流式微球技术在真菌毒素检测中的应用

流式微球技术是集悬浮芯片技术和流式细胞技术于一体的新型分析技术，具有灵敏度高、检测速度快、组合灵活、反应动力学快的特点，将其与免疫分析技术相结合，在多残留检测领域具有很大的应用前景。Qu 等[42]选取黄曲霉毒素M1、赭曲霉毒素A、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、伏马毒素B1等4 种霉菌毒素作为模型分析物，建立了针对牛奶中多种霉菌毒素检测的流式微球技术，与传统的ELISA 方法相比，所建立的方法具有更低的检测限。然而，目前流式微球技术主要采用有机荧光染料和量子点制备编码微球。这两种材料都为下转换荧光编码材料，易受基质的影响，常伴有不同程度的背景荧光干扰，进而导致检测灵敏度的下降。Zhang 等[43−44]利用上转换荧光编码磁性微球UCNPMMs 在免疫分析检测领域进行了初步的探索，构建了针对黄曲霉毒素B1检测的流式荧光免疫分析技术。因此，降低流式微球技术背景荧光干扰、简化样品前处理步骤成为目前流式微球技术用于实际样品多残留检测中亟待解决的问题。

6 时间分辨荧光免疫分析技术在真菌毒素检测中的应用

时间分辨荧光免疫分析技术是一种新型的超微量免疫标记分析方法，相较于酶标记免疫分析和放射免疫分析，其具有灵敏快速、操作简便、线性范围宽、无放射性、无背景光干扰等优点。Wang 等[45]利用Eu 纳米粒子作为标记材料建立了一种基于时间分辨荧光的快速、灵敏的黄曲霉毒素B1的免疫层析定量检测方法，结合时间分辨荧光传感和免疫层析的优点，该方法针对黄曲霉毒素B1检测限（LOD）为0.1 μg/kg，回收率为87.2%～114.3%。Tang 等[46]制备了增强荧光的Eu/Tb（III）纳米球作为标记，并与抗个体基因型的纳米体（AIdnb）和单克隆抗体（mAb）偶联。在纳米膜-抗体结合的基础上，建立了两种竞争性时间分辨条带方法（AIdnb-TRFICA 和mAb-TRFICA），并进行了比较。AIdnb-TRFICA 对黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的半抑制浓度分别为0.46和0.86 ng/mL，比mAb-TRFICA 方法的灵敏度高18.3倍和20.3 倍。

7 展望

本文综述了免疫分析技术在真菌毒素检测中应用的现状，如表1 所示。目前，免疫分析技术因其简便，快速，灵敏及经济等优点而被越来越多地应用于大量样品的快速检测，显示出其巨大的发展潜力和广阔的应用前景。但是，该技术应用于真菌毒素快速分析领域仍存在一些需要深入研究和开发的问题:现有研究表明[47]，同一样品中多种真菌毒素共同存在的可能性极大，多毒素间协同作用可增强毒素的体内毒性作用。因此，建立同时检测多种真菌毒素的快速、灵敏、准确检测方法有重要的现实意义；免疫分析检测法需要将真菌毒素偶联蛋白作为包被抗原，制备过程困难且存在对环境和人员有毒有害、价格昂贵等问题。因此，寻找抗原替代品，实现“绿色化”检测真菌毒素迫在眉睫。近来通过噬菌体展示技术制备模拟表位肽取代抗原，表现出制备成本低，抗体效能好，是未来真正实现无毒无害检测非常重要的研究方向[48−49]；免疫分析法需要制备特异性抗体，而抗体制备需要动物免疫等步骤制备成本高，时间长，受免疫原性限制且无法分离交叉反应的物质。相比抗体，适配体作为一种可体外化学合成、结构稳定、具有高亲和性和特异性的“化学抗体”，完善了免疫分析检测出现的不足[50]，是未来的发展方向。

表1 基于不同标记物的免疫分析技术在真菌毒素检测中的应用Table 1 Application of different labeling materials-based immunoassay in mycotoxins detection