南极磷虾油提取方法及生理活性研究进展

周 莉，张明浩，姚家旭，杨 富

（中南民族大学药学院，湖北武汉 430074）

南极磷虾（Euphausia superba）是一种主要以浮游动植物为食，生活在南极海域的群居生物，资源充足，在南极海域的生态系统中起着重要作用[1]。以新鲜南极磷虾或干燥磷虾粉为原料，利用合适的提取方法可得到南极磷虾油[2]。作为一种新型的海洋功能性油脂，南极磷虾油含有丰富的营养成分，包括磷脂（Phospholipid，PL）、多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids，PUFA）、虾青素（Astaxanthin，AST）、维生素A（Vitamin A，VA）、生育酚（Tocopherols，TOC）等[3−4]，PUFA中二十碳五烯酸（Eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA），已被证明具有多种生理活性[5]。近年来研究表明，南极磷虾油对人体健康有多种益处，包括抗炎、预防心血管疾病、抗糖尿病、促进大脑功能和抗癌作用[2]。充足的资源与其具有的多样功能特性使得南极磷虾油极具研究价值与开发前景。本文论述了近年来南极磷虾油的提取方法和生物活性的研究进展，并进行总结与展望，以期为南极磷虾油的开发应用提供参考。

1 南极磷虾油的提取

南极磷虾或者经过初步加工的干制磷虾粉均可用于磷虾油的提取，磷虾捕捞死亡后快速自溶，氟含量升高不利于后续处理[6]，以冷冻磷虾或干燥磷虾粉为原料更适合于南极磷虾油提取。目前南极磷虾油的提取方法主要有溶剂法、临界流体法和酶法，与之对应，图1 选取3 篇相关文献并展示了其中南极磷虾油活性物质的含量[3,7−8]。在溶剂法中，使用极性溶剂乙醇提取磷虾油具有较高的PL（39.20%）和EPA+DHA（28.66 g/100 g）含量，但AST 含量（149.85 mg/kg）和TOC（28.66 mg/100 g）含量较低，丙酮与之相反[3]；在临界法中，超临界CO2与亚临界正丁烷提取磷虾油均具有较多AST（262.2、248.4 mg/kg）和EPA+DHA（29.81、29.85 g/100 g），而PL 含量差异显著（18.1%、28.7%）（P<0.05）[7]；最后，碱性蛋白酶对比复合蛋白酶提取磷虾油具有更高的PL（50.19%）、EPA+DHA（36.91 g/100 g）、AST（520.75 mg/kg）、TOC（39.28 mg/100 g）含量[8]。由此可见，不同提取方式与条件对南极磷虾油品质存在着较大影响。上述数据来源于不同文献，不能直接比较三种提取方法优劣，下文对三种磷虾油提取方法进行简要介绍。

图1 不同提取方法对磷虾油组成的影响Fig.1 Effects of different extraction methods on the composition of krill oil

1.1 溶剂提取法

溶剂提取法是提取油脂的经典方法，也是文献报道中提取南极磷虾油最常用的方法。南极磷虾油中具有极性PL，中性甘油三酯和疏水性AST 与TOC[3]，提取溶剂的选择会显著影响南极磷虾油的产品质量。

在单一溶剂提取条件下，极性溶剂，如乙醇和异丙醇的提取物具有较高的脂质产量和磷脂含量，但甾醇、虾青素和维生素含量较低；丙酮提取的脂质产量和磷脂含量最低，但微量元素含量较高[3]。乙醇因具有适当的极性与绿色低毒特性被广泛应用于磷虾油提取。张晓慧等[9]使用不同比例的乙醇-水混合溶剂实现了南极磷虾油的提取（95%乙醇）、精炼（无水乙醇）和富集（30%乙醇），最终得到磷虾油中PL 含量为706.1 mg/g，EPA 和DHA 含量分别为23.9%，14.2%。这种一体化生产工艺在磷虾油工业化生产上具有重大价值。

依次以丙酮、正己烷、乙醇为提取溶剂，每次提取15 min，经三步提取后从磷虾粉中提取得到三种磷虾油。丙酮提取油中，AST、TOC、VA、胆固醇等次要成分较集中；而乙醇提取油的PL 和PUFA 含量最高，但微量组分少；正己烷提取油则介于二者之间[4]。多步提取不仅使磷虾油营养价值最大化，也可为后续虾油特定组分收集提供基础。而利用混合溶剂进行提取既可以获得更多的活性物质，同时避免了多步繁琐操作。Tian 等[10]采用乙酸乙酯-正丁醇混合溶剂（1:1，V/V）进行磷虾油提取，仅提取5 min 后得到的磷虾油中PL 含量为27.7%～42.3%，总产油率为4.15%～6.18%。采用乙醇、正己烷或其混合溶剂（1:2，V/V）提取磷虾油得率分别为21.32%、8.50%和18.75%，PL 含量分别为64.82%、30.20%、55.41%，该混合溶剂同样可作为合适的提取溶剂，提取油中PUFA 含量高[11]。在另一项乙醇-正己烷混合溶剂提取磷虾油研究中，若溶剂组成中乙醇>正己烷，提取液不分层，此时降低溶剂中乙醇比例能够增加油脂产率，在乙醇:正己烷=3:2 时提取率达最高74.49%；若正己烷>乙醇，则提取液在静置30 min 后发生分层现象，在乙醇:正己烷=2:3 时，总油脂提取率可达95.23%（乙醇层54.77%，己烷层40.46%）[12]。

上述溶剂提取磷虾油研究中，往往需要使用大量溶剂，料液比达1:6～1:30（W:V），同时耗费较长时间。通过寻找新的提取溶剂或者改进提取方法可以改善这一现象，例如采用亲水性可调溶剂N-二甲基环己胺提取南极磷虾油，该方法溶剂用量少，对环境友好且提取效率与氯仿/甲醇提取相当[13]。另外较为新颖的离子液体或生物溶剂等同样可应用于油脂的提取，然而其在磷虾油提取领域鲜有报道[14]。从改进提取方法角度来看，在乙醇提取虾油前使用1.0%柠檬酸钠溶液浸泡处理干粉，可提高虾油中的磷脂含量与流动性，并且降低其酸值。因为柠檬酸钠能与虾油中的蛋白质结合，去除磷虾油中的蛋白质、游离脂肪酸等杂质[15]。在溶剂提取油脂时引入辅助条件，如超声辅助溶剂提取可以提高出油率并减少提取时间[16]，这是值得尝试的一种南极磷虾油提取方法。

1.2 超临界和亚临界流体法

超临界流体法（supercritical fluid extraction，SFE）是利用超临界流体从原料中提取出特定组分的一种方法，在超临界状态下，超临界流体同时具有气、液的扩散、溶解能力，从而提供更优的提取效率，在食品、化工等行业渐受欢迎[17−18]。在高价值脂类产品生产中，使用CO2或以丙烷和二甲醚为替代超临界流体是当前的发展趋势[19]。

CO2超临界温度在31.1 ℃和7.38 MPa，可提取非极性、低分子量的弱极性化合物，其绿色安全特性使之成为油脂提取的主要溶剂[19]。赵泓博[20]将CO2-SFE 与溶剂法相结合，在CO2-SFE 提取过程中，无论夹带剂乙醇的存在与否，所得油脂绝大部分为甘油三酯。而延长提取时间可提高磷脂含量，经CO2临界提取150 min 后的虾油磷脂含量可超过97%，同时增加后续乙醇提取磷虾粉产物中的EPA 和DHA 含量。除此之外，其创新性地探究了向CO2-SFE 中添加大豆油作载体助溶剂对南极磷虾油提取的影响，结果发现，大豆油载体助溶剂不仅能提高磷虾油产率与EPA 和DHA 含量，还能够改变其产品特性，比如增加其氧化稳定性与流动性，减弱不良风味。刘志东等[21]比较了CO2-SFE、溶剂法与压榨法对南极磷虾油的提取效果，结果表明CO2-SFE 的油脂产率接近压榨法，低于溶剂法（无水乙醇），但CO2-SFE 产物的酸值与碘值均较高。

亚临界流体法（subcritical fluid extraction，SubFE）利用亚临界流体为萃取剂，根据极性相似原理提取特定组分，亚临界状态是指相对于近临界和超临界状态存在的一种形式，萃取条件相对温和[22]。具有较低的临界压力、温度及适当亲脂性，丙烷和丁烷是广泛应用于油料提取的两种流体[23−24]。比较n-butane-SubFE、CO2-SFE 和有机溶剂法提取南极磷虾油，结果表明，n-butane-SubFE 提取磷虾油具有超过CO2-SFE 的脂质回收率（81.2%）、PL 含量（28.7 g/100 g）和TOC含量（67.7 mg/kg），以及超过乙醇提取的AST 含量（248.4 mg/kg），且其脂质氧化程度低[7]。随后Liu等[25]发现，选择二甲醚为SubFE 流体，得到的磷虾油相对于n-butane-SubFE 而言，具有更高的脂质回收率（93.77%）、PUFA 含量（33.49%）和AST 含量（218.06 mg/kg）。利用临界流体法提取南极磷虾油，除流体种类外，温度、压力、流速等参数条件都需要大量实验进行探究。孙德伟等[26]采用单因素实验对n-butane-SubFE 提取南极磷虾油条件进行了优化，在最佳条件下（提取时间120 min，压力1.0 MPa，温度40 ℃）脂质提取率为21.39%，磷脂含量为28.68%，其中71.20%为磷脂酰胆碱。

1.3 酶解法

在植物油脂提取过程中，使用蛋白酶、纤维素酶、果胶酶或其他酶混合降解细胞壁可提高油脂收率[27]，其中，蛋白酶可使脂质与蛋白质分离，以此促进使磷虾油的释放[28]。在提取南极磷虾油前加入中性蛋白酶和碱性蛋白酶进行酶解，与空白组相比，酶解磷虾粉的油脂提取率显著上升，其中碱性蛋白酶组提取率高于中性蛋白酶组，但中性蛋白酶组具有更高的AST、EPA 和DHA 含量[29]。对常用六种蛋白酶（木瓜蛋白酶、复合蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、胰酶、碱性蛋白酶）酶解提取南极磷虾油比较研究发现，碱性蛋白酶和复合蛋白酶提取磷虾油的油脂收率较高（5.29%和4.90%），以碱性蛋白酶辅助提磷虾油中PL（50.19%）和微量元素含量，其效果均高于另外五种蛋白酶[8]。将碱性蛋白酶与复合蛋白酶一同加入以提取磷虾油，提取效果同样优于溶剂提取[28]。Zhou 等[30]研究了不同种类酶的提取效果，包括中性蛋白酶、胰蛋白酶、复合蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶，结论与前文一致，复合蛋白酶的脂质回收率最高。经响应曲面优化提取条件后（酶浓度0.16%，45 ℃下酶解2.9 h），磷虾油提取率可达86.02%。

南极磷虾内源酶活性极强，在捕捞死亡后容易发生自溶，故可以利用南极磷虾自溶酶结合外源酶对其进行酶解[31]。外源木瓜蛋白酶与内源酶能够产生协同作用，在中性条件下酶解2 h 所得南极磷虾油中EPA+DHA 质量分数大于两者单独作用[32]。合理利用内源酶可以减少外源酶使用量，甚至不需要使用外源酶。以大豆油为溶剂，从自溶6 h 的南极磷虾水解物中富集营养成分，回收油中含有44.24 mg/kg的AST，总脂肪酸中含有1.1% EPA 和0.6% DHA[33]，这与上文中大豆油做载体助溶剂提取磷虾油的研究相似，均体现了绿色提取理念。虽然利用蛋白酶解能提高脂质成分的产率，但是上述文献中酶解所需时间较长（2～6 h），该方法仍需要进一步改良。

2 南极磷虾油的生理活性

南极磷虾油含有丰富的营养成分，如EPA、DHA、PL、TOC、VA、AST 等，其中DHA 和EPA 能够促进大脑发育，改善脑功能，调节脂质和糖代谢。有研究证实，磷脂形式存在的DHA/EPA 在发挥其功能特性方面优于甘油三酯或乙酯形式[5]，而高磷脂含量正是南磷虾油组成特征之一[2]。虾青素属于类胡萝卜素类，有显著的抗氧化能力，研究发现虾青素具有抗炎、抗氧化、促凋亡、抗癌等多种生物活性[34]。多种营养成分共同存在于南极磷虾油中，使之具有较大的健康益处。关于磷虾油的功能特性目前已经进行了大量的研究，从细胞、动物以及临床试验中发现，南极磷虾油具有抗炎、抗氧化、预防心血管疾病、抗糖尿病、促进大脑功能和抗癌等作用[2]，表1 列出了部分关于磷虾油生理活性的研究进展，包括其功能作用、磷虾油组成与实验方法及结论。文献中使用的南极磷虾油不尽相同，部分来源于商品磷虾油，部分来源于实验室提取，导致其品质和发挥功效的生理活性物质种类和含量存在差异，这种差异在南极磷虾油功能活性研究中是需要考虑的。

表1 部分磷虾油生理活性的研究Table 1 Partial study on physiological activity of krill oil

2.1 心血管保护作用

血浆中的甘三酯（Triglyceride，TG）、总胆固醇（Total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白胆固醇（Highdensity liptein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（Low density lipoprotein cho lesterol，LDL-C）等水平异常是引发心血管疾病的重要潜在性危险因素[52]。在高脂肪食物中添加磷虾油能够降低LDLC，显著改善C57BL/6J 小鼠的血脂异常、脂肪肝和葡萄糖代谢，此外还能降低肝脏的氧化损伤[35]。与之类似，正常饮食大鼠服用南极磷虾油与鱼油后，磷虾油相比鱼油有着更强的降低血清TG 和TC 能力[36]。磷虾油与鱼油均有降低血脂和调节脂质稳态的作用，但作用机制不同，作用效果也不同。鱼油降低极低密度脂蛋白（Very low density lipoprotein，VLDL），磷虾油降低血浆非酯化脂肪酸[37]。磷虾油还能引起肠道菌群结构发生剂量依赖性改变，此变化与高脂血症的减轻有关[38]。在志愿者饮食中添加南极磷虾油同样产生了降总胆固醇作用，能够有效降低心血管疾病风险[39]。磷虾油除降低TG、TC 水平及高血压大鼠的血压外[40]，Parolini 等[41]还证明了南极磷虾油和磷虾蛋白对载脂蛋白E 缺乏小鼠动脉粥样硬化的发展有延缓作用。

2.2 抗炎作用

炎症是机体对有害物质产生的一种反应，被认为是机体的有益过程，但同样会引起机体不适，例如发热和疼痛，此外，慢性炎症与类风湿关节炎、哮喘、炎症性肠病、牛皮癣等疾病密切相关[2]，为了减轻疼痛和减少慢性炎症的发生，在自然界中寻找具有优异镇痛抗炎活性物质一直是医药学科的研究热点[53]。南极磷虾油能够对TFN-α和TFN-γ诱导产生炎症的CACO-2、HT29 细胞进行处理，结果使促炎细胞因子mRNA 表达减少，上皮完整性增加，从而减轻肠道炎症的发生[42]。经臭氧处理后磷虾油能减少脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激RAW 264.7 细胞IL-1β、IL-6、TNF-α的表达[43]。向患有轻度膝关节疼痛受试者的饮食中补充南极磷虾油，膝关节炎量表和血尿生化参数显示南极磷虾油具有抑制促炎性介质和减缓骨关节炎发展的作用[44]。

2.3 神经保护作用

大多数神经退行性疾病，如阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）和帕金森氏病（Parkinson’s disease，PD）起因复杂，但往往与神经炎症相关，因此，对氧化途径和炎症反应的抑制是治疗神经退行性疾病的一个研究方向[54]。南极磷虾油可能通过抑制细胞凋亡反应和氧化损伤预防甲基苯丙胺诱导的神经毒性[45]。磷虾油对LPS 诱导AD 小鼠模型神经炎症的影响研究表明，饮食中添加磷虾油抑制了诱导型一氧化氮合酶和环氧合酶-2 的表达，降低了活性氧和丙二醛的水平，能够减轻氧化应激和神经炎症引起的脑损伤，降低淀粉样变性的产生和改善记忆功能[46]。而在半乳糖诱导脑衰老小鼠实验中，磷虾油减少了多巴胺和cAMP 调节蛋白以及参与钙通道蛋白的表达，缓解肠道菌群的失调，对脑衰老产生有益作用[47]。通过生化参数测定及水迷宫实验等方法评价磷虾油喂食对小鼠认知功能的影响，结果表明，磷虾油可通过减少海马Aβ42水平和降低氧化损伤，改善认知功能及减轻焦虑，南极磷虾油可作为具有神经保功效的食品补充剂和或功能性成分[48]。

2.4 改善骨质疏松作用

骨质疏松症可导致骨脆性增加，骨折几率增高，是最常见的骨骼疾病，多见于绝经后女性和老年男性，且女性的患病率高于男性。随着老龄化程度增加，骨质疏松症已成为各国所面临的健康问题[55]。对糖皮质激素性骨质疏松小鼠补充南极磷虾油90 d后，通过小鼠的骨密度、生物力学强度和松质骨微观结构，证明了南极磷虾油可显著防止骨丢失，改善糖皮质激素诱导的骨质疏松症，促进骨的形成[49]。与之相似，分别给予ICR 小鼠大豆油与磷虾油作饮食补充剂，发现磷虾油通过GH/IGF-1 通路促进了骨的纵向生长，并增加了骨骼肌矿物质含量和强度[50]。对软骨退变小鼠补充磷虾油8 周后改善了其软骨结构，抑制了软骨细胞的增生性分化与关节软骨的异常凋亡[51]。此外，南极磷虾磷酸化肽对去卵巢大鼠同样具有改善松质骨结构和生化特性的功效[56]。

3 总结与展望

南极磷虾油作为一种新型的海洋功能性油脂，含有丰富的营养成分，对人体健康有多种益处，具有广阔的应用前景。传统溶剂法提取磷虾油是目前最常用的一种提取方式，技术成熟，成本低、步骤少，未来新型绿色溶剂的开发与提取工艺优化可解决溶剂用量大，回收处理困难以及提取时间长等不足。酶解法提取磷虾油条件温和，绿色环保且油脂产率高，外源酶与内源酶的协同作用使酶解法更适于鲜虾的提取，外源酶的种类是提取过程中最重要的影响因素，另外，酶解耗时长也是需要考虑的问题。临界流体法虽然对设备要求高，但能够通过控制提取条件改变临界流体的选择，极具灵活性，因此需要在诸多试验基础上优化提取参数，使之适于磷虾油的提取。未来南极磷虾油提取技术的突破创新将会对磷虾油应用研究产生很大推动作用。

南极磷虾油产生各种功能活性作用的机制复杂，虽有一定报道，但并不全面，其如今研究较多的是对血脂的调节作用。此外，许多学者在研究中仅关注南极磷虾油中EPA 和DHA 成分含量，但在这之外还存在多种活性物质，这些物质之间是否存在相互作用，又或者各自发挥不同的生理活性作用仍不清楚，南极磷虾油组成与其功效之间的关系如何，这些问题亟待未来研究探寻。