云南牛肝菌不同部位三种重金属含量特征及风险评价

陈凤霞，杨天伟，李杰庆，刘鸿高，范茂攀, ，王元忠

（1.云南农业大学资源与环境学院，云南昆明 650201；2.云南省农业科学院药用植物研究所，云南昆明 650200；3.云南省热带作物科学研究所，云南景洪 666100；4.云南农业大学农学与生物技术学院，云南昆明 650201）

现代工业化发展加剧了重金属污染，其中工业废水、汽车尾气排放、农药化肥残留、矿产资源开发成为主要污染来源[1−2]。重金属在大气、土壤、生物中分布广泛，难以降解，较强的富集性、持久性和不可逆转性使重金属污染问题日趋严重[3]。重金属通过生物链进入人体，与人体中蛋白质和酶发生相互作用，影响人体正常机能，此外，还能积蓄在器官中，造成慢性中毒，危害人体健康[4]。Cd、As、Pb 均被列入美国环保署（United States Environmental Protection Agency）有害空气污染物名单。Cd 摄入过多会导致肾损害及心血管疾病[5]。美国毒物和疾病登记署（ATSDR）与国际癌症研究机构（IARC）将Cd 归类为第7 位危害人体健康的物质和人类致癌物。过量的As 会损害肠胃与皮肤病[6]，Pb 则会损害脑细胞，影响胎儿发育[7]。

菌类具有修复污染土壤及固体废物、参与化合物有机质的降解与转化的功能，具有较强的重金属富集能力，也可用于生物监测，评价产区重金属污染水平[8−10]。我国食用菌资源丰富，根据中国报告网及中国海关统计2019 年食用菌总产量3961.91 万吨，出口金额达到3323947 千美元，具有较大的经济价值。然而，国内外研究中食用菌重金属超标问题却屡见不鲜[11−13]。Liu 等[14]测定云南16 个地区食用菌7 种重金属含量，结果显示，云南食用菌重金属污染严重，As、Pb、Cd 含量超出国家标准值。Sun 等[15]测定云南40 个地区8 种野生食用牛肝菌元素含量，其中包括重金属元素Pb、Cd，结果表明，牛肝菌中Pb 元素范围在0.41～0.70 mg/kg 之间，低于法定限值，Cd 元素在0.51～15.14 mg/kg 之间，明显超出法定限值；灰褐牛肝菌对Cd 的富集能力较强，Cd 是牛肝菌中主要的重金属来源。Zhang 等[16]采用电感耦合等离子体质谱法测定云南三种野生菌矿质元素含量，并对其重金属元素As、Cd、Pb 进行健康风险评估，结果表明，部分样品重金属含量高于粮农组织/卫生组织食品添加剂联合专家委员会建议的限度，云南牛肝菌科蘑菇有毒元素含量偏高。我国菌类重金属研究较为单一，本文对牛肝菌重金属进行了多种分析，包括子实体重金属含量分析、污染情况和食用风险评价。

Kokkoris 等[17]测定了希腊地区6 种野生菌和土壤重金属元素，发现蘑菇中Pb、Ni 含量较高，有毒重金属Pb 含量范围为2.80～8.43 mg/kg 之间，超过法定限量，存在食用潜在风险。Igbiri 等[18]对尼日利亚尼日尔三角洲地区三种食用菌重金属进行健康风险评估，结果显示食用菌中重金属含量超过规定摄入量，Ni 含量超标，具有一定致癌风险。Schlecht 等[19]测定了德国柏林地区野生食用菌中重金属元素Cd、Pb 含量，结果表明，大部分野生蘑菇样品中两种重金属含量均超过欧盟标准。在相关菌类重金属研究文献中，研究人员对菌类重金属含量及影响进行了大量的研究分析，但却忽略了不同污染评价方法和国家相关标准导致结果的差异性。本文中的研究内容分析角度全面，弥补了以往研究中的不足，较为新颖。

测定云南9 种牛肝菌不同部位有毒重金属As、Cd、Pb 含量，利用单因子污染指数、内梅罗综合污染指数和相关限量标准评价牛肝菌重金属污染与健康风险，以期为云南牛肝菌资源开发与消费者合理膳食提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

灰褐牛肝菌（A）40 份、美味牛肝菌（B）60 份、皱盖疣柄牛肝菌（C）40 份、砖红绒盖牛肝菌（D）26 份、绒柄牛肝菌（E）47 份、金黄柄牛肝菌（F）19 份、灰疣柄牛肝菌（G）17 份、红疣柄牛肝菌（H）20 份、黑绒盖牛肝菌（I）21 份。牛肝菌共计290 份，采自于云南各个地区，详情见图1 和表1，均由云南农业大学刘鸿高教授进行品种鉴定。将不同种类不同地区的牛肝菌样品进行分类，使用陶瓷刀去除表面杂物及泥土，自来水清洗干净后用蒸馏水润洗三遍。菌盖与菌柄分开置于烘箱中50 ℃烘干至恒重。粉碎后过100 目标准筛，置于自封袋备用；65% HNO3、30%H2O2广东西陇化工股份有限公司；茶叶标准物GBW07605 地矿部物化探研究所；元素标准储备液 济南众标科技有限公司；超纯水（电阻率>18.25 MΩ.cm）。

图1 云南省牛肝菌采样点示意图Fig.1 Sketch map of Boletaceae sampling points in Yunnan Province

表1 9 种牛肝菌样品代号及产地Table 1 Sample code and origin of 9 boletus mushroom samples

ICPE-9000 电感耦合等离子体原子发射光谱仪 日本岛津公司；FW-100 型高速粉碎机 天津市华鑫仪器厂；101A-1 型电热鼓风恒温干燥箱 上海崇明实验仪器厂；Mars6 微波消解仪 美国CEM 公司；UPT-I-10 超纯水机 优谱科技有限公司；奥豪斯电子分析天平 Ohaus 仪器有限公司；100 目不锈钢筛盘 浙江上虞市道墟五四仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 牛肝菌重金属元素测定 每份样品粉末准确称取300 mg 置于微波消解罐，加入5 mL HNO3与3 mL H2O2微波消解仪进行消解，微波消解条件设置为4 步骤，功率和升温时间均为1500 kW 与5 min，温度设置分别为120、150、170、180 ℃。消解完毕冷却并使用超纯水定容25 mL，摇匀澄清待测。相同方法消解茶叶标准物，制备空白对照，使用HNO3将各元素标准储备液配制成0.00、0.02、0.05、0.10、0.50、1.00 μg/mL 建立元素标准曲线。

1.3 牛肝菌重金属污染评价

内梅罗（Nemero）综合污染指数法主要用于评估水质、土壤、食品重金属污染水平，也是常见的污染评价方法[20−21]。单因子污染指数分级标准为：Pi≤1无污染、13 重污染。内梅罗综合污染指数分级标准为：Psum≤0.7安全，清洁、0.73 重污染，受到严重污染。本文采用单因子污染指数法和内梅罗（Nemero）综合污染指数法对每种牛肝菌样品进行重金属污染评价。

其污染指数计算公式如下[22−23]：

注：公式（1）中Pi为牛肝菌中重金属i 的污染指数；Ci为牛肝菌重金属i 的实测浓度；Si为牛肝菌重金属i 的评价标准值（根据《GB2762-2017 食品安全国家标准 食品中污染物限量》）。公式（2）中Psum为某产地牛肝菌综合污染；表示牛肝菌中重金属i 单因子污染指数平均值；Pimax表示牛肝菌中重金属i 的污染指数最大值。

1.4 牛肝菌的潜在健康风险评估

2010 年FAO/WHO JECFA 取消了原先制定的Pb 暂定每周可耐受摄入量25 μg/kg 与As 每周最大耐受摄入量0.015 mg/kg，并认为人体对Pb、As 暴露量越低越好，无法确定限量标准对人体健康进行有效保护。考虑到数据分析的局限性，本研究仍采用2010 年之前对于Cd、Pb、As 的每周可耐受摄入限量标准，分别为：Cd≤0.007 mg/kg、As≤0.015 mg/kg、Pb≤0.025 mg/kg。

所有数据采用Microsoft Excel 2014 软件初步整理后运用SPSS18.0 进行描述统计与相关性分析，采用目标危害系数法（THQ）计算摄入风险。其风险评估计算相关公式为[24]：

注：公式（3）中THQi为重金属i 的目标危害系数；BW 为消费者体重（60 kg）；ED 为牛肝菌暴露年限（70 年）；EFR为牛肝菌暴露频率（365）；FIR为牛肝菌日摄入量；AT 为牛肝菌平均作用时间（ED×365）；Ci为牛肝菌中重金属i 浓度；RfD 为重金属每日最大耐受摄入量标准；TTHQ 为综合目标危害商数。

1.5 数据处理

在元素含量测定中，每个样品重复三次，每测定三个样品进行一次空白试验对照用于减少仪器的不稳定性以减少误差。元素数据使用Excel 2007 进行数据统计整理，采用Epess Statics 20 单因素方差分析法对数据进行显著性差异分析。

2 结果与分析

2.1 元素测定方法准确性分析

如表2 所示，三种元素Cd、Pb、As 测定波长分别为214.438、220.353、189.042 nm，检出限0.0104、0.1243、0.5634 μg/L。样品元素回收率在105%、95%、93.1%，标准物元素测定值与标准值非常相近，分别在0.060 与0.057 mg/kg、4.2 与4.4 mg/kg、0.283 与0.280 mg/kg，说明此方法准确可靠。

2.2 不同部位牛肝菌Cd、Pb、As 含量分析

牛肝菌味道鲜美，富含多种维生素和矿质元素，但牛肝菌对重金属也具有较强的富集能力，重金属超标会使人体健康受到影响。牛肝菌菌盖、菌柄中重金属含量及重金属比值见表3。牛肝菌菌盖Cd、Pb、As 含量在0.36～20.89 mg/kg、0.21～4.42 mg/kg、0.26～13.33 mg/kg 之间。牛肝菌菌柄Cd、Pb、As 含量在0.07～19.91 mg/kg、0.59～18.48 mg/kg、0.29～17.10 mg/kg 之间。牛肝菌不同部位对重金属的吸收存在差异性。对相同种类、部位不同产地牛肝菌进行差异性分析，发现大部分牛肝菌重金属含量具有显著性差异（P<0.05），牛肝菌对重金属元素的富集可能与产地有关。Schlecht 等[19]测定了德国柏林地区野生食用菌中重金属元素Cd、Pb 含量，结果表明，大部分野生蘑菇样品中两种重金属含量均超过欧盟标准。我国规定了食品中污染物限量（GB2762-2017），食用菌及其制品中有毒重金属元素限量分别为Cd≤0.5 mg/kg、Pb≤1.0 mg/kg、As≤0.5 mg/kg。表3 中部分牛肝菌样本Cd、Pb、As 含量超标，牛肝菌菌盖Cd、Pb、As 超标率为91.43%、77.14%、82.86%；菌柄Cd、Pb、As 超标率分别为68.57%、77.14%、82.86%，相同部位不同品种的牛肝菌重金属元素含量差异明显，大部分牛肝菌菌盖重金属大于菌柄。Cd 在牛肝菌菌盖中的超标率远大于菌柄，这与Zhang 等[25]对美味牛肝菌不同部位矿质元素的研究结果一致。比较不同部位重金属元素含量（Q（c/s））可知，91%的牛肝菌Cd 含量菌盖大于菌柄。60%的牛肝菌Pb 含量菌柄大于菌盖。51%的牛肝菌As 含量菌盖大于菌柄。此结果表明Cd、As 更易富集在牛肝菌菌盖，Pb 易富集在牛肝菌菌柄。

表2 茶叶标准物（GBW 07605）矿质元素含量及检出限Table 2 Mineral elements contents in tea standard（GBW 07605）and limits of detection

表3 云南牛肝菌中有毒重金属含量及菌盖与菌柄含量之比（mg/kg dm）Table 3 The content of toxic heavy metals in Boletaceae in Yunnan and the ratio of the content of the cap to the stipe (mg/kg dm)

2.3 牛肝菌重金属污染评价

菌类具有较强的重金属富集能力，研究菌类重金属污染问题可为了解产区重金属污染状况、优化环境，合理资源开发提供借鉴意义。大部分牛肝菌样品重金属污染状况严重，牛肝菌中相同部位不同种类，相同种类不同部位的污染程度具有差异。从单因子污染指数来看，处于轻度污染与重度污染的样品数较多。Cd 在牛肝菌中超标率最高，其次是Pb 和As。根据表4 可知，重度污染且超过50%的牛肝菌菌盖样品有绒柄牛肝菌66%（As）、灰褐牛肝菌100%（Cd）、美味牛肝菌65%（Cd）、金黄柄牛肝菌52.6%（Cd）。无污染且超过50%的牛肝菌菌盖样品有灰褐牛肝菌62.5%（As）、绒柄牛肝菌53.1%（Cd）；灰褐牛肝菌67.5%（Pb）；砖红绒盖牛肝菌57.7%（Pb）；金黄柄牛肝菌52.6%（Pb）。

表4 牛肝菌污染程度占比（%）Table 4 Proportion of pollution degree of Boletaceae(%)

Pb 重度污染率最高为灰疣柄牛肝菌（70.6%）菌柄与红疣柄牛肝菌（65%）的菌柄，而菌盖重度污染率仅仅为0%和5%。多数样品Pb 重度污染率菌柄高于菌盖，也就说明菌柄比菌盖更易富集Pb。处于重度污染且超过50%的牛肝菌菌柄样品有绒柄牛肝菌66%（As）、灰褐牛肝菌100%（Cd）、灰疣柄牛肝菌70.6%（Pb）、红疣柄牛肝菌60.5%（Pb）。绒柄牛肝菌和灰褐牛肝菌的菌柄菌盖重度污染率均为66%与100%。表5 中灰褐牛肝菌Cd 的Pi最高，为73.53，超出重污染最低限制的24.51 倍，属于重度超标，牛肝菌受不同重金属污染程度具有差异性，可能与牛肝菌对不同重金属的富集能力有关。内梅罗综合污染指数分级标准为：Psum≤0.7 安全，清洁、0.73 重污染，受到严重污染。梅罗综合污染指数结果显示，金黄柄牛肝菌菌盖菌柄的As-Psum值最小（1.79、1.82）；其次是灰褐牛肝菌（1.86、2.56），它们的梅罗综合污染指数相对较低，属于轻度污染与中度污染之间。灰褐牛肝菌菌盖菌柄的Cd-Psum值（55.12、28.16）与灰疣柄牛肝菌的Cd-Psum值（31.45、52.56）属于严重污染。皱盖疣柄牛肝菌菌盖菌柄的Pb-Psum值最大（6.49、24.96），属于严重污染。金黄柄牛肝菌菌柄的Pb-Psum值最小（1.47），属于轻度污染。研究结果显示，不同种类牛肝菌中均有超标现象，其中Cd 是牛肝菌重金属污染的主要特征污染元素。

表5 牛肝菌单一污染指数和内梅罗综合污染指数的统计表Table 5 Statistical table of Boletaceae single pollution index and Nemero comprehensive pollution index

2.4 不同部位牛肝菌膳食健康风险评价

根据联合国粮农组织和世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会（FAO/WHO JECFA）推荐的暂定每周可耐受摄入量（Provisionally tolerable weekly intake，PTWI）结合目标危害商数对不同种类牛肝菌进行膳食健康风险评价。假设一个60 kg 的成年人每周摄入300 g 新鲜牛肝菌，则根据公式（3）（4）计算出不同种类牛肝菌的单一重金属目标危害商数（THQ）和综合目标危害商数（TTHQ）。由表6 可知，食用牛肝菌均有摄入重金属危害人体健康的风险。通过牛肝菌目标危害商数分析可知，除了砖红绒盖牛肝菌菌柄与绒柄牛肝菌菌柄的Cd-THQ<1，其他种类牛肝菌的Cd-THQ>1。菌盖Cd-THQ>1 的比例为100%。菌柄Cd-THQ>1 的比例为78%，范围在0.597～18.157 之间，最小值与最大值相差30 倍。Cd 在牛肝菌综合健康风险中占比最大，城市密集地区蔬菜重金属污染研究中也发现Cd 更易富集在蔬菜里[22]。牛肝菌菌盖As-THQ、Pb-THQ 范围为0.464～6.499、0.580～7.957。牛肝菌菌柄As-THQ、Pb-THQ 范围在0.520～1.281、0.470～3.282 之间，牛肝菌具有不同程度重金属摄入风险。如表6 所示，9 种牛肝菌综合目标危害商数（TTHQ）大于1，不同重金属的THQ 对综合健康风险的贡献率具有差异。总体来说，摄入牛肝菌的重金属健康风险较大，建议消费者适量食用。

表6 不同种类牛肝菌的单种重金属目标危险度（THQQ）和总目标危险度（TTHQ）Table 6 Target hazard quotient (THQ) of single heavy metal and totaltarget hazard quotient (TTHQ)of different species of Boletaceae

3 结论

本试验采用ICP-MS 法测定云南省9 种牛肝菌重金属含量，分析元素含量特征、差异性及富集特点，结合GB2762-2017 与FAO/WHO 相关限量标准对牛肝菌进行重金属污染评价和膳食暴露风险。结果表明，牛肝菌中As、Cd、Pb 均有不同程度超标，Cd 是牛肝菌主要的有毒重金属来源，牛肝菌菌盖对Cd 的富集较多，而Pb 更易富集在牛肝菌菌柄中。单因子污染指数与内梅罗综合污染指数显示，处于轻度污染与重度污染的样品数较多，Cd 是牛肝菌重金属污染的主要特征污染元素。健康风险评价结果表明，所测牛肝菌综合目标危害商数均大于1，且数值较大，大量食用牛肝菌有摄入重金属危害人体健康的风险。牛肝菌是一种常见的野生食用菌，具有较大的食用价值和经济价值，对云南牛肝菌重金属进行分析，有利于当地资源合理开发利用，也为消费者提供合理的膳食依据。本研究在食用菌重金属污染控制问题方面尚难以解决，对于野生菌类进行人工驯化栽培，减少子实体重金属富集将是今后研究的重要方向。