β-环糊精对中性红包合及应用的研究

＊刘长远

（贵州省有色金属和核工业地质勘查局二总队 贵州 553000）

中性红是应用十分广泛的指示剂[1]，当其接触到酸性溶液时，能够观察到荧光现象。考虑到β-环糊精能够发挥增敏的功效。故本实验采用β-环糊精包合中性红，并研究了β-环糊精包合中性红反应的最佳条件，最后运用β-环糊精-中性红包合物荧光猝灭法测定NO2-，确定制备的最佳条件，提出了能够测量NO2-的方法，最低能够检测出2.11×10-3mg/L的NO2-。利用这一方法测量样品含量，获得较好的结果[2]。

1.实验部分

(1)仪器

EL204电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；

CARY50紫外-可见分光光度计（美国 VARIAN）；

B3200S超声仪（必能信超声（上海）有限公司）；

RF-5301PC荧光分光光度计（日本岛津）。

(2)试剂

0.067mol/L KH2PO4溶液：取4.54g的KH2PO4固体溶于500mL的容量瓶中，稀释至刻度配成0.067mol/L KH2PO4溶液；

0.067mol/L Na2HPO4溶液：取9.46gNa2HPO4固体溶于1000mL的容量瓶中，稀释至刻度配成0.067mol/L Na2HPO4溶液；

1.0×10-3mol/L中性红溶液：取0.2888g的中性红固体溶于100mL的容量瓶中，稀释至刻度配成1×10-2mol/L的母液，取上述母液10mL置于100mL的容量瓶中，稀释至刻度配成1×10-3mol/L的溶液；

5.0×10-3mol/Lβ-环糊精溶液：取1.419g的β-环糊精固体于250mL的容量瓶中，稀释至刻度配成5×10-3mol/L的溶液；3.0mol/LHCl溶液：取25mL12mol/L的浓盐酸于100mL的容量瓶中，稀释至刻度配成3mol/L HCl溶液；

10mg/L NaNO2溶液：取1g的NaNO2固体溶于1000mL容量瓶中，稀释至刻度配成1g/L的NaNO2溶液母液，取上述母液10mg置于1000mL容量瓶，稀释至刻度配成10mg/L的溶液。

所有试剂均为分析纯，实验过程中使用的水均为超纯水。

(3)实验部分

①包合物的制备

精准量取2.0mL缓冲溶液（pH值7.6）、1.0mL中性红溶液（1.0×10-3mol/L），以及适量的β-CD溶液（5.0×10-3mol/L），依次掺入10mL比色管里面，不断添水，直至总体积达到10mL，混合直至均匀，超声5min，静置15min，利用荧光分光光度计，在波长470nm位置测量荧光强度并记录下来。

②NO2

-的测定在25mL比色管中依次添加1.0mL的NO2-，0.50mL的β-CD-中性红包合物溶液，不断添水，直至总体积达到10.0mL，然后添加0.50mL的3mol/L的HCl溶液，混合直至均匀，25min后，继续加水，定容到25mL，在λex为470nm的激发下，在λem为590nm位置测量试剂以及空白的荧光强度，分别用F和F0表示。

2.结果与讨论

(1)包合物的制备

①包合物的形成

量取2.0mL缓冲溶液（pH7.6）、1.0mL中性红溶液（1.0×10-3mol/L）、依次取1.0mL，2.0mL，3.0mL，4.0mL，5.0mL的β-CD溶液（5.0×10-3mol/L），添加到10mL比色管中，继续加水，直至总体积达到10mL，混匀，超声5min，在实验室中放置15min，然后利用荧光分光光度计在波长470nm位置对溶液进行测量。在450～700nm范围内测定体系的荧光强度，见图1。

对图1进行分析能够确定，在470nm波长位置，反应产生的产物包合物的发射上限值出现在590nm位置，在随着β-环糊精加入量的增加，荧光增强，证明环糊精具备荧光增敏的功能。

图1 中性红包合物的形成

1：5.0×10-3mol/Lβ-CD；2：1.0×10-3mol/L的中性红；3：1mLβ-CD与中性红；4：2mLβ-CD与中性红；5：3mL β-CD与中性红；6：4mLβ-CD与中性红；7：5mLβ-CD与中性红。

②酸度的选择

移取相同体积而pH值分别为6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0的KH2PO4-Na2HPO4缓冲液、1.0mL中性红（1.0×10-3mol/L、以及适量的β-CD溶液（5.0×10-3mol/L），依次倒入10mL比色管中，不断加水，直至体系的体积达到刻度位置，混合达到均匀状态后，超声5min，在实验室中放置15min，于荧光分光光度计上，在470nm位置进行测量。结果表明，在缓冲液pH值持续增大的过程中，体系的ΔF先是不断增大，达到顶点时，pH值为7.6，然后不断降低。由此确定最终的pH值为7.6。

③反应稳定时间

准确移取2.0mL缓冲溶液（pH为7.6）、1.0mL中性红溶液（1.0×10-3mol/L）、少量β-CD溶液（5.0×10-3mol/L），依次倒入10mL比色管里面，不断加水，直至体系的体积达到刻度位置，混合达到均匀状态后，超声5min，分别静置5min、10min、15min、20min、30min、35min、60min、90m in，利用荧光分光光度计在470nm波长位置进行测量。最后可知，在15min以内，体系的荧光强度和室温放置时间之间为正相关关系，15min时体系的荧光强度达到峰值，且较为稳定，而15min之后的荧光强度减弱，因此选择反应稳定时间为15min。

④试剂加入顺序的影响

为了揭示出试剂添加顺序和β-CD包合中性红之间的关系，需要以添加顺序为唯一变量进行实验：A.缓冲液+中性红+β-CD；B.缓冲液+β-CD+中性红；C.中性红+缓冲液+β-CD；D.中性红+β-CD+缓冲液；E.β-CD+缓冲液+中性红；F.β-CD+中性红+缓冲液。按包合物形成的实验方法配制溶液，将溶液放在超声仪中超声5min，在实验室环境下放置15min，然后进行测量。结果发现：荧光强度和试剂添加顺序之间存在关联，上述第A组的荧光强度超过其他组，由此确定应该按照缓冲液、中性红、β-CD的顺序添加。

(2)包合物的表征

①中性红包合前后的荧光强度比较

量取2.0mL缓冲溶液（pH7.6）、1.0mL中性红溶液（1.0×10-3mol/L）、2.0mL的β-CD溶液（5.0×10-3mol/L），依次倒入10mL比色管里面，然后加水，直至体系的体积达到刻度位置，混合达到均匀状态后，超声5min，在实验室中放置15min，于荧光分光光度计上，在470nm波长位置进行测量。如下图2。

图2 中性红包合前后的荧光光强的比较

1：5.0×10-3mol/L的β-CD；2：1.0×10-3mol/L中性红；3：5.0×10-3mol/L的β-CD与1.0×10-3mol/L中性红。

由图2可知，1为β-CD溶液没有荧光强度；2为中性红溶液有较强的荧光强度；3为β-CD与中性红，其荧光强度远超过中性红，且发射波长偏移，由此证明产物包合物和β-CD具备荧光增敏的功能。

②中性红包合前后的吸收曲线比较

准确移取2.0mL缓冲溶液（pH7.6）、1.0mL中性红溶液（1.0×10-3mol/L）、2.0mL的β-CD溶液（5.0×10-3mol/L），依次倒入10mL比色管里面，然后加水，直至体系的体积达到刻度位置，混合达到均匀状态后，超声5min，在实验室中放置15min，通过紫外分光光度计测量吸光度，如下图3。

图3 中性红包合前后的吸收曲线

1：5.0×10-3mol/L的β-CD；2：1.0×10-3mol/L中性红；3：5.0×10-3mol/L的β-CD与1.0×10-3mol/L中性红。

由图3可知，1为β-CD没有吸光度；2为中性红有较强的吸光度；3为β-CD与中性红，其吸光度比中性红大，说明了β-CD有增敏作用。

(3)NO2-的测定

①盐酸用量的影响

分别量取1.0mL的NO2-和0.50mL的β-CD-中性红包合物溶液，先后添加到25mL比色管里面，接着不断添水，直至体系体积达到10.0mL，分别加入3mol/L的盐酸0.10L、0.30L、0.50L、0.70L、0.90L、1.10L，摇晃达到均匀状态，反应25min后，定容，整体放置在λex为470nm的条件下，在λem为590nm位置进行测量。在不断掺入盐酸的过程中，体系的ΔF值增大；当盐酸用量为0.5mL时，ΔF值最大；之后的ΔF值随着盐酸用量的增大而急剧减小，所以选盐酸用量为0.5mL作为体系的反应环境。

②反应时间的影响

分别量取1.0mL的NO2-和0.50mL的β-CD-中性红包合物溶液，先后添加到25mL比色管里面，接着不断添水，直至体系体积达到10.0mL，接着掺入0.50mL的3mol/L的HCl溶液，摇晃直至均匀状态，将溶液放置2min、6min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、60min，定容，在λex为470nm的条件下，于λem为590nm处进行测量。结果表明，在25min以内，体系的ΔF值和反应时间之间为正相关关系；在25min时，ΔF值最大；之后的ΔF值随着时间的增长而减小，所以选择25min为反应时间。

③试剂加入顺序的影响A.NO2-+中性红包合物+HCl，B.NO2-+HCl+中性红包合物，基于上述两种添加顺序进行配制，轻微摇晃直至达到均匀状态，25min后，用水定容，在λex为470nm的条件下，于λem为590nm位置进行测量。结果发现，试剂加入顺序是影响ΔF值的因素之一。按照A顺序添加，能够实现更大的ΔF值，因此在实验中确定采用先中性红包合物后HCl的顺序添加。

(4)标准曲线的绘制

在确定的盐酸用量为0.5mL，反应时间为10min，按照NO2-+中性红包合物+HCl顺序掺入时，量取10mg/L的NO2-0.0mL、1.0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10.0mL，按1.2.2的实验方法配制溶液，25min后，不断掺水，定容，接着进行测量。如下图4。

图4 标准曲线

由图4可知，当NO2-不超过4.5mg/L时，其和F之间为线在同等条件下测量12次空白，计算平均值，根据s2={（x1-x）2+（x2-x）2+…+（xn-x）2}/（n-1）计算得到的标准偏差为9.76×10-3，用3S除以工作曲线的斜率K，此时得到的检测限为2.11×10-3mg/L。也就是说，该方法具有良好的精密度。

(5)样品分析

分别取适量自来水和水城河水样，于25mL的比色管中先后添加1.0mL的NO2-，0.50mL的β-CD-中性红包合物溶液，不断添水，直至体系的总体积为10.0mL，接着倒入0.50mL的3mol/L的HCl溶液，轻微摇晃直至达到均匀状态，10min后加水定容，在λex为470nm的条件下，于λem为590nm位置，测量出试剂和空白的荧光强度，分别为F和F0，见表1。

表1 水样中NO2-的测定

表2 水样中NO2-的测定

3.结论

中性红、β-环糊精在pH值为7.6的Na2HPO4-KH2PO4缓冲液中，放置时间为15min时，可以合成β-CD-中性红包合物，包合物的荧光强度比中性红的荧光强度高，通过本文提出的方法，测量水含有的NO2-是完全可行的，具有较大的应用潜力[3-4]。