布鲁菌Ⅳ型分泌系统非依赖型效应蛋白BspI诱导巨噬细胞内质网应激

任晶晶，李 晨，彭其胜

(吉林大学 人兽共患病研究所/教育部人兽共患病研究重点实验室， 吉林 长春 130062)

布鲁菌病(简称布病)是由布鲁菌侵入机体后引起的传染-变态反应性人兽共患细菌病，被列为我国法定传染病中的乙类传染病之首。布鲁菌是典型的胞内寄生菌，其毒力在于细胞内生存和增殖[1]。内质网是细胞内蛋白质合成、加工运输和分泌的主要场所，对于维持细胞稳态具有重要作用。内质网不仅在机体抵抗胞内感染中发挥重要作用，并且还是多种胞内寄生菌逃避宿主免疫杀伤的理想靶位点[2]。布鲁菌的入侵和增殖同样与内质网有着紧密的联系[3]。研究发现布鲁菌在宿主细胞的内质网内生存与繁殖，能导致内质网的结构重组，产生内质网应激[1]。近年来学者们发现布鲁菌感染会诱发内质网应激中的未折叠蛋白反应[4-6]。

布鲁菌分泌的效应蛋白可以分为Ⅳ型分泌系统依赖性的和Ⅳ型分泌系统非依赖性的2种。目前国内外研究表明，Ⅳ型分泌系统依赖性效应蛋白在调节布菌感染诱发内质网应激反应中发挥重要调节作用[4-5]。但是，随着对布鲁菌感染机制的深入研究，学者们发现了4种比较特殊的效应蛋白BPE159、BspG、Bsp和BspK，这些分泌到宿主细胞内的效应蛋白不依赖于Ⅳ型分泌系统的存在[5,7]，即使布菌的Ⅳ型分泌系统被缺失，它们依然能分泌到宿主细胞的包浆内。然而，关于Ⅳ型分泌系统非依赖效应蛋白调节内质网应激反应的功能目前未知。

通过分析这4种Ⅳ型分泌系统非依赖性蛋白，发现BspI蛋白由布鲁菌的一号染色体基因BAB1-1865编码，含有3个独特的结构域：信号肽域(1～17 aa)、转膜域(17～33 aa)及GTPase活化域(98～220 aa)[5]。其中GTPase活化域理论上能够调节内质网小G蛋白的活性，影响内质网的组装，暗示着可能参与布鲁菌感染引起的内质网应激[8]。因此，本研究选取Ⅳ型分泌系统非依赖效应蛋白BspI作为研究对象，探究其在未折叠蛋白反应中的相关调节功能。

1 材料与方法

1.1 质粒与试剂PGEX-4T-1载体购自吉林安舍科技公司；T4DNA连接酶、限制性核酸内切酶为TaKaRa公司产品；DNA Marker、衣霉素为北京索莱宝公司产品；胶回收纯化试剂盒和质粒小提试剂盒为天根公司产品；Anti-rabbit IgG antibody-HRP购自Bioworld公司；Anti-Bip IgG购自Affinity公司；Anti-XBP1 IgG和Anti-his IgG购自Santa公司；细胞因子ELISA检测试剂盒购自博士德生物公司；反转录试剂盒购自莫纳公司；细胞RNA提取试剂盒购自天根公司；CCK-8试剂盒购自MCE公司；Glutathione Beads购自天地人和生物有限公司。

1.2 引物的设计与合成以灭活(80℃，2 h)的S19菌液为模板，根据布鲁菌S19标准株的BspI基因(NC_007618.1)设计上游和下游引物进行扩增。设计BspI基因引物序列见表1，由吉林库美生物公司合成。扩增程序按照Premix TaqTM说明书设置(TaKaRa公司Cat.#:RR901)。

表1 引物序列及扩增片段大小

1.3 GST-BspI融合蛋白的表达、纯化及Pull-down试验首先运用基因克隆方法构建PGEX4T-1-BspI原核表达载体,然后按照文献[9]进行GST-BspI融合蛋白的表达纯化及Pull-down试验。将SDS-PAGE切胶，送到上海殴易生物公司进行质谱分析。

1.4 BspI蛋白的原核表达、纯化及鉴定将目的基因插入pET-28a(+)载体中，构建pET-28a-BspI原核表达载体，经PCR及测序鉴定正确后，转入大肠杆菌BL21(ED3)感受态细胞，以1.0 mmol/L的IPTG诱导重组蛋白BspI表达。利用AKTA蛋白纯化系统纯化BspI蛋白。以Anti-his tag IgG为一抗，HPR标记的羊抗鼠IgG为二抗，对纯化后的重组蛋白进行Western blot鉴定。

1.5 CCK-8细胞毒性试验将RAW264.7细胞铺于96孔板中，分别设置试验组、对照组以及空白组。试验组分别加入不同质量浓度的BspⅠ蛋白(10，20，40，80 mg/L)，每组设置3个平行孔，置于5% CO2、37℃的细胞培养箱中培养24 h。然后每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续培养1 h后使用酶标仪测定各孔D450 nm值，计算各组细胞存活率。

1.6 BspI蛋白对RAW264.7细胞Bip及IL-6和TNF-α表达影响将RAW264.7细胞铺于6孔板中，分别将质量浓度为40，60 mg/L的BspI蛋白加入到6孔板中以刺激细胞。设置阳性对照即内质网应激激活剂衣霉素作用组及阴性对照组。24 h后利用Western blot检测Bip蛋白表达。用双抗夹心ELISA试剂盒检测IL-6和TNF-α的表达。

1.7 BspI蛋白对RAW264.7细胞未折叠蛋白反应相关分子mRNA水平的影响为检测未折叠蛋白反应相关分子IRE1、PERK、ATF6、GAPDH、XBP1和ATF4在mRNA水平的表达量，根据所需要检测基因在基因库中mRNA的序列，设计IRE1 (XM_005694366.1)、PERK(XM_005686691.1)、ATF6(AY942654)、GAPDH(XM_005680968.1)、XBP1(XR_3106431)和ATF4(NM_001142518.1)基因的定量引物，引物序列见表2。利用细胞RNA提取试剂盒提取经BspI刺激24 h后的RAW264.7细胞RNA，再利用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，进行qPCR检测。反应程序：95℃ 30 s，95℃ 15 s，60℃ 1 min，共34个循环。

表2 引物序列及扩增片段大小

1.8 BspI蛋白对RAW264.7细胞未折叠蛋白反应相关蛋白表达的影响取BspI刺激24 h后的RAW264.7细胞及阴性对照利用Western blot检测XBP-1表达情况，同时利用免疫荧光检测XBP-1的表达。免疫荧光样品制备步骤：用4%多聚甲醛4℃固定30 min，PBS洗涤后用0.1%曲拉通-100作用10 min。PBS洗2次后用5%BSA室温固定1 h，以Anti-XBP-1为一抗，1∶100稀释后4℃过夜。PBS洗2次，二抗1∶500稀释后室温避光孵育1 h，最后在荧光显微镜下进行观察。

2 结果

2.1 GST-BspI融合蛋白的表达纯化及质谱分析以布鲁菌S19株灭活菌液为模板，扩增出BspI基因，结果显示在675 bp处有单一DNA条带，与预期大小相符(图1A)。将构建的PGEX-4T-1-BspI转化至大肠杆菌BL21中，IPTG诱导表达后纯化。SDS-PAGE结果显示，成功纯化出GST-BspI融合蛋白(图1B)。与RAW264.7细胞Pull-down后可见差异蛋白，进行质谱分析发现BspI可与Bip蛋白结合(图1C)。

2.2 BspI蛋白的原核表达、纯化及鉴定将构建成功的pET28a-BspI载体转化至大肠杆菌BL21中，用IPTG诱导BspI蛋白表达。SDS-PAGE分析结果显示，重组BspI蛋白在37℃条件下表达量较16℃条件下表达量多，且大部分形成包涵体，少部分为可溶蛋白(图2A)。利用AKTA蛋白纯化系统对可溶蛋白进行纯化，SDS-PAGE分析后结果显示，400 mmol/L咪唑洗脱效果最优(图2B)。Western blot分析证明，重组BspI蛋白可以被His-tag抗体特异性识别(图2C)。

A.BspI蛋白可溶性分析(M1.蛋白质相对分子质量标准，1.pET28a(+)空载体诱导产物，2.37℃诱导pET28a(+)-BspI全菌，3.37℃诱导pET28apET28a(+)-BspI超声上清，4.37℃诱导pET28apET28a(+)-BspI超声沉淀，5.16℃诱导pET28apET28a(+)-BspI全菌，6.16℃诱导pET28apET28a(+)-BspI超声上清，7.16℃诱导pET28apET28a(+)-BspI超声沉淀)；B.不同咪唑浓度洗脱液SDS-PAGE分析(M2.蛋白质相对分子质量标准，8.20 mmol/L咪唑洗脱液，9.50 mmol/L咪唑洗脱液，10.200 mmol/L咪唑洗脱液，11.400 mmol/L咪唑洗脱液，12.500 mmol/L咪唑洗脱液)；C.BspI重组蛋白Western blot鉴定(13.诱导空载体菌液,14.37℃诱导菌液)

2.3 BspI对RAW264.7细胞存活率的影响CCK-8试验结果(图3)显示，BspI质量浓度为80 mg/L时，细胞存活率显著性下降(P<0.001)，而质量浓度为40 mg/L时，细胞存活率与对照组相比并没有明显变化。因此后续采用质量浓度为40，60 mg/L 的BspI刺激细胞，检测未折叠蛋白反应发生，明确BspI刺激质量浓度。

1.对照组；2.10 mg/L BspI蛋白；3.20 mg/L BspI蛋白；4.40 mg/L BspI蛋白；5.80 mg/L BspI蛋白；6.160 mg/L BspI蛋白

A.BspI基因PCR扩增(M1.DL2000 DNA Marker,1.BspI基因的PCR产物)；B.GST-BspI融合蛋白的纯化(M2.蛋白质相对分子质量标准，2.纯化后的GST-BspI融合蛋白，3.纯化后的GST蛋白)；C.质谱差异蛋白分析(4.GST-BspI融合蛋白Pull-down结果，5.GST蛋白Pull-down结果)

图1 GST-BspI表达载体鉴定、融合蛋白的表达纯化和质谱差异蛋白分析

2.4 BspI蛋白对RAW264.7细胞未折叠蛋白反应标志性分子Bip及相关细胞因子表达影响收集衣霉素处理的阳性对照组、PBS处理的阴性对照组及BspI蛋白刺激组的细胞，裂解后进行Western blot检测。结果如图4A所示，质量浓度为60 mg/L的BspI蛋白刺激RAW264.7细胞24 h后，Bip蛋白表达量显著升高，引起的未折叠蛋白反应更为显著。由于TNF-α和IL-6与未折叠蛋白反应有关，因此对TNF-α和IL-6进行ELISA检测，结果显示(图4B，C)，RAW264.7细胞TNF-α和IL-6的表达显著提高(P<0.001,P<0.05)。

A.不同质量浓度BspI重组蛋白刺激RAW264.7细胞Bip表达量鉴定(1.衣霉素阳性对照组，2.60 mg/L BspI作用组，3.40 mg/L BspI作用组，4.PBS阴性对照组)；B.BspI对RAW264.7细胞TNF-α表达的影响；C.BspI对RAW264.7细胞IL-6表达的影响

2.5 BspI蛋白对RAW264.7细胞未折叠蛋白反应相关分子转录水平影响上述结果表明BspI可以引起RAW264.7细胞的未折叠蛋白反应。为明确相关通路，利用实时荧光定量PCR检测BspI对参与未折叠蛋白反应的3条信号通路相关分子mRNA转录的影响。结果表明，BspI蛋白刺激RAW264.7细胞24 h后，IRE1与XBP-1的mRNA表达量较对照组有显著升高(图5C，E；P<0.01，P<0.05)，而PERK、ATF6与ATF4的mRNA表达量较对照组无明显变化(图5A，B，D)。

A.ATF6;B.PERK;C.IRE1;D.ATF4;E.XBP-1

2.6 BspI蛋白对RAW264.7细胞XBP-1蛋白表达的影响分别利用Western blot与免疫荧光检测试验组与对照组的XBP-1蛋白表达情况，结果显示(图6)，试验组的XBP-1蛋白表达水平显著升高，与对照组相比有极显著性差异(P<0.001)。

A.XBP-1S在不同处理组的表达(1.TM阳性对照组，2.PBS阴性对照组，3.BspI处理组)；B.免疫荧光检测XBP-1在RAW264.7细胞表达

3 讨论

布鲁菌感染宿主细胞后，通过细胞内吞作用进入细胞质中，形成早期布鲁菌菌泡，历经中期布鲁菌菌泡，最后与细胞内质网发生融合，形成复制型布鲁菌菌泡。从此，布鲁菌在细胞内开始增殖，显示其毒力[10-12]。目前已知布鲁菌在与细胞内质网互作时，能诱导细胞内质网应激，通过未折叠蛋白反应等实现内质网功能稳定，促进布鲁菌的胞内生存[13]。用TUDCA(一种未折叠蛋白反应的抑制剂)处理宿主细胞能显著抑制布鲁菌在细胞内的增殖[6,14]。可见未折叠蛋白反应在布鲁菌的胞内生长中发挥重要作用。PERK、IRE1和ATF6是未折叠蛋白反应的3条信号通路的重要分子。当未折叠蛋白反应未发生时， Bip能结合这3个分子的内质网内端，使它们处于非活化状态。当未折叠蛋白反应发生时，Bip表达增加，Bip与未折叠蛋白结合，解除对这3个分子的抑制作用，激活UPR反应的3条信号通路，恢复细胞内环境稳态。由此也可见，Bip是未折叠蛋白反应的关键性调控分子[13]。

本研究发现布鲁菌BspI蛋白能够与Bip结合，因此推测布鲁菌BspI蛋白能够引起宿主细胞的未折叠蛋白反应。为此，首先表达并纯化BspI蛋白，确定BspI刺激所需质量浓度后通过Western blot检测发现未折叠蛋白反应标志分子Bip蛋白表达量显著增加。同时，通过实时荧光定量PCR、Western blot和免疫荧光试验发现巨噬细胞在受到BspI蛋白刺激后，巨噬细胞中的XBP-1S表达量增加。XBP-1由无活性的XBP-1U转化为有活性的XBP-1S是未折叠蛋白反应发生的重要标志之一。表明BspI激活了巨噬细胞未折叠蛋白反应，从而证明布鲁菌BspI蛋白在巨噬细胞内质网应激调控中发挥重要作用

布鲁菌感染导致的巨噬细胞内质网应激能诱导炎症因子，如TNF-α和IL-6的产生[15]。在本研究中利用ELISA试剂盒检测巨噬细胞受到BspI刺激后，细胞培养上清液中TNF-α与IL-6分泌量情况。结果发现BspI蛋白刺激可以显著引起炎性因子TNF-α与IL-6的分泌，这从另一个角度证明BspI能诱导巨噬细胞内质网应激的发生。

综上所述，本研究证明布鲁菌BspI蛋白可以引起巨噬细胞内质网应激反应，且主要是通过未折叠蛋白反应中的IRE1通路。同时还提出了Ⅳ型分泌系统非依赖性效应蛋白在布鲁菌感染导致的内质网应激反应中发挥重要调控作用。本研究发现Ⅳ型分泌系统非依赖性效应蛋白也可以参与布鲁菌感染导致的宿主细胞内质网应激的调控，丰富了布鲁菌感染的机制研究，为未来进一步研究内质网应激反应提供新思路。