高效液相色谱串联质谱法测定普洱茶生茶中116种农药残留

◎ 伍旭东，毛静春，罗正刚，彭 权，谭文涵

（普洱市质量技术监督综合检测中心，云南 普洱 665000）

当今世界，经济全球化、贸易自由化进程日益加快，世界各国对农产品和食品中要求检测的农药、兽药残留项目越来越多[1]。我国是茶叶生产大国和贸易大国之一，但近几年来，发达国家规定的茶叶的检测项目不断增加，欧盟2020年的新标准中规定了486种农药项目，日本在2020年的新标准中规定了208种农药项目。我国最新的国家标准也将茶叶农残项目检测增加到了65项，另外，欧盟、德国、日本等国家和地区还对标准中未列出的其他农药作了相应规定，这就大幅度扩大了茶叶的检测项目，而目前有关茶叶中农残的检测已有报道[2-3]，但茶叶中农药多残留检测，涉及不同极性和溶解度的各类化合物，再加上茶叶基质复杂，含有色素、生物碱等有机物质和铁、钙、锌等无机元素等成分[2]，进一步增加了提取、净化和检测的难度。茶叶行业可持续发展的需求及分析仪器的不断改进，促进了茶叶农药残留分析技术的发展，特别是色谱-质谱技术在农药多残留中的应用已成为分析化学领域的研究方向和热点[3-9]。多残留检测通常是指检测多种的农药残留，它能够做到同时对单一样品中可能存在的百种以上农药进行检测。采用多残留检测，可以获得更有效和更准确的农药监控，同时也是一种节省人力的方法，并可节省样品制备和仪器运行成本。以往的检测方法检测的农药数量有限，而且只能针对某一类的农药，即便是有茶叶中多农药残留检测的，也是分别净化、分别进样，并且不使用质谱检测器，无法对阳性样品确证，无法满足国外越来越多、越来越严格的茶叶检测项目。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

SCIEX ExionLC液相仪、Triple Quad 3500三重四级杆质谱仪（美国AB Sciex公司）；Kinetex Biphenyl C18色谱柱（100 mm×3.0 mm，2.6 μm，美国飞诺美公司）；PV-1型小型漩涡混匀器（德国IKA公司）；电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；Diret-Q5型超纯水机（法国Milipore公司）；AS3120A型超声清洗仪（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；M27942B型移液枪（德国Eppendorf公司）；多通道氮吹仪（美国Organomation公司）。

本实验所用溶液标准物质为混标，见表1，购于天津阿尔塔科技有限公司，各类物质浓度均为10 μg·mL-1。

乙腈（色谱纯，美国J.T.Bake试剂公司）；甲酸、柠檬酸钠、柠檬酸氢二钠（色谱纯，美国Sigma公司）；N-丙基乙二胺（PSA）、碳18（C18）、墨化炭黑（GCB）（天津博纳艾杰尔科技有限公司）；硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠、柠檬酸氢二钠（分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司）。

表1 116种农药的质谱参数表

续表1

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1.2 标准溶液的配制

准确移取1 mL混合标准物质于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，避光4 ℃保存。

1.3 样品前处理

1.3.1 样品提取

（1）方法1。称取2 g茶叶样品（精确到0.01 g），至50 mL离心管中，加入20 mL乙腈，混匀，超声提取30 min，接着振摇提取30 min，4 200 r·min-1离心5 min，取10 mL上清液至25 mL试管中，45 ℃水浴中氮吹浓缩至2 mL，待净化。

（2）方法2。称取2 g茶叶样品（精确至0.01 g）于50 mL塑料离心管中，加入10 mL水，放置30 min。加入10 mL乙腈，振荡15 min。再加入4 g硫酸镁、1 g氯化钠和1 g柠檬酸钠和0.5 g柠檬酸氢二钠，剧烈振荡1 min，以3 000 r·min-1离心5 min，准确移取上清层（乙腈层）6 mL至15 mL塑料离心管中，待净化。

1.3.2 样品净化

（1）方法1。活化Cleanert-TPT柱，5 mL乙腈+甲苯（3+1，V/V）溶液淋洗1次，弃去流出液，下接50 mL试管，放入试管架上待用；将浓缩提取液移至Cleanert-TPT柱中，2 mL乙腈+甲苯（3+1，V/V）溶液洗涤试管3次，15 mL乙腈+甲苯（3+1，V/V）洗脱；待所有液体收集完毕后，取下试管；45 ℃水浴中氮吹至干；加入1 mL乙腈+0.1%甲酸水（2+8，V/V）定容，超声波溶解，经0.45 μm微孔滤膜过滤后，供液相色谱串联质谱仪（LC/MS/MS）分析。

（2）方法2。向待净化的离心管里加入450 mg PSA、450 mg C18、200 mg GCB、900 mg硫酸镁，振荡混匀30 s，以3 000 r·min-1离心5 min，取3 mL上清液于试管中，氮气缓缓吹干，1 mL乙腈+0.1%甲酸水（2+8，V/V）复溶，过0.45 μm的滤膜，供液相色谱串联质谱仪（LC/MS/MS）分析。

1.4 分析条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex Kinetex Biphenyl（100 mm×3.0 mm，2.6 μm）；柱温：40 ℃；进样量：20 μL；流动相：A相为水（5 m mol·L-1甲酸铵），B相为乙腈（5 mmol·L-1甲酸铵）；流速：0.4 mL·min-1；梯度洗脱程序：0～0.5 min，5%B；0.5～3 min，5%B→60%B；3～7 min，60%B→80%B；7～15 min，80%B→90%B；15～16 min，90%B→95%B；16～17 min，95%B→97%B；17～17.1 min，97%B→5%B；17.1～20 min，5%B。

1.4.2 质谱条件

离子源：ESI源，正离子模式。检测方式：多反应检测（MRM）。离子源温度：300 ℃。喷雾电压：5 500 V。气帘气：30 psi。雾化气：50 psi。辅助气：60 psi。碰撞气：Medium。其他质谱参数见表1。

2 结果与分析

2.1 净化效果比较

通过SPE法和QuEChERS法净化后浓缩定容后的样品溶液，QuEChERS法共提物较多，SPE法得到的样品溶液是无色透明溶液，QuEChERS法得到的样品溶液是浅黄色透明溶液。这些现象说明SPE法的净化液中杂质含量较少。对比分析了SPE和QuEChERS法处理茶叶空白样品的总离子流图（TIC），两种方法的TIC图总体比较一致，但由于QuEChERS法在处理过程中提取液与试剂接触时间较短，很多杂质在净化过程中没有处理干净，导致TIC图基线较高。而在SPE柱在净化过程中，提取液以较低的流速通过SPE柱，这使得提取液与吸附剂充分接触，从而能有效去除大量的茶叶中水溶性和脂溶性的杂质（如多酚类、有机酸、咖啡碱和色素等）。

在茶叶样品中添加116种农药标准溶液，添加水平0.02～0.1 mg·kg-1，添加静置30 min后，SPE和QuEChERS两种净化方法制备两个添加样品，进行平行实验，结果见表2。由表2可见，对于平均回收率在70%～80%的农药，SPE法占11%，QuEChERS法占17.2%；平均回收率在80%～100%范围内的农药，SPE法占80%，QuEChERS法占63.8%，同时，SPE法和QuEChERS法RSD小于10%的农药数量分别占95.2%和87%，表明两种方法的重复性和再现性均良好。

表2 两种提取方法普洱茶中116种农药平均回收率和RSD表

对于两种方法所需的时间和成本进行评估，以完成一个样品为例，SPE耗时70 min左右，其中以洗脱和旋转蒸发步骤最为耗时。此外，SPE法还耗费了约45 mL的乙腈和10 mL的甲苯。而QuEChERS只耗时20 min左右，耗费约20 mL的乙腈。相比之下，QuEChERS法的操作更为简单快捷，且有机溶剂用量少，实验成本低，在处理大批量样品时具有明显的优势。QuEChERS虽然省时省力，但净化效果不如SPE，对仪器会造成一定的污染，仪器设备需要经常维护

2.2 浓缩方式的比较

通过116种农药的添加回收率实验，对比了旋转蒸发浓缩和氮吹浓缩对实验结果的影响，实验结果见表3。旋转蒸发浓缩条件：水浴45 ℃；转速：4 000 r·min-1；真空-220 psi。氮吹浓缩条件：水浴50 ℃；氮气压50 psi。

表3 旋转蒸发和氮吹浓缩效率对比表

从表3可以看出，两种浓缩方式均可达到回收率在70%～120%和RSD＜15%的要求，在浓缩环节两种方法得出的实验结果并无太大差异。单个样品30 mL洗脱液浓缩时间，旋转蒸发需要4 min，而氮吹浓缩需要10 min，旋转蒸发比氮吹浓缩速度快，但氮吹同时可对42个样品进行浓缩，而旋转蒸发要逐个浓缩，并且需要有人持续操作设备，浓缩样品要不断轮换，样品多的情况下效率比较低，所以氮吹浓缩在同时处理多样品的情况下有比较大的优势。

2.3 线性范围与检出限

如表4所示，利用外标法116种农药进行定量，将116种目标化合物用甲醇配制成系列质量浓度混合标准溶液，在优化的色谱和质谱条件下进行测定，以目标化合物质量浓度为横坐标（x，μg·L-1）、定量离子对的峰面积为纵坐标（y）绘制标准曲线，得到线性方程和相关系数。结果表明，目标化合物在0.004～0.100 μg·L-1范围内具有良好的线性关系，相关系数均大于0.099 8。在空白样品中添加116种农药标准溶液，以S/N=3确定方法的检出限（LOD），以S/N=10确定方法的定量限（LOQ），结果如表3所示，样品中116种目标化合物的LOD为0.000 3～0.1 mg·kg-1，LOQ为0.000 9～0.1 mg·kg-1。

表4 116种农药线性方程、相关系数、检出限、定量限表

续表4

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2.4 方法的回收率和精密度

在空白样品中添加116种农药进行添加回收率试验，对方法的回收率及精密度进行考察。在空白基质中添加0.05 mg·kg-1、0.1 mg·kg-1、0.5 mg·kg-13个水平的混合标准溶液，每个水平进行6次平行试验，得到的平均回收率和精密度（n=6）。结果表明116种目标化合物的平均回收率为71%～118.8%，相对标准偏差（RSD）为0.5%～9.8%，可以满足农药残留分析的要求。

3 结论

本方法采用液相色谱-串联质谱法，结合QuEChERS净化技术，建立了一次前处理，同时可测普洱茶中116种农药残留的系列高通量方法，该方法具有提取时间短、溶剂用量少、萃取效率高的特点，提高了检测速度和检测通量