桃胶多糖脱蛋白工艺研究

◎ 亓希武，房海灵，陈泽群，梁呈元，吕 寒

（江苏省中国科学院植物研究所，江苏省植物资源研究与利用重点实验室，江苏 南京 210014）

桃胶是桃等蔷薇科植物的树干受到机械损伤或病原菌侵染后分泌的物质，颜色为淡黄色至黄褐色或桃红色。桃胶自然风干或用其他方法脱水干燥后形成的固体物质称为原桃胶，原桃胶经去杂、水解、脱色、干燥等工艺加工后可得商品桃胶[1]。商品桃胶的性质与阿拉伯胶类似，在食品、化工等领域具有广泛的应用前景[2-3]。此外，桃胶具有药食兼备的特点，研究表明其具有降血糖、降血脂、免疫调节等作用[4-6]。

桃胶的主要成分为多糖，此外还含有少量杂质和蛋白质[7]。在桃胶多糖的制备工艺中，脱蛋白是提高桃胶多糖纯度和品质的重要环节。本实验以桃胶水解液为原料，以蛋白脱除率和多糖保留率为主要指标，对常用的Sevage法、三氯乙酸（TCA）法、木瓜蛋白酶法和盐酸法这4种脱蛋白方法进行了比较研究[8-10]，以确定适用于桃胶多糖制备的脱蛋白工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桃胶采自江苏省南京市栖霞区八卦洲街道桃园；Bradford法蛋白测定试剂盒、木瓜蛋白酶，购自生工生物工程上海（股份）有限公司；Na2CO3、NaHCO3、蒽酮、硫酸、TCA、盐酸、葡萄糖、牛血清白蛋白、氯仿和正丁醇等均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

FD-1A-50型冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）、Quintix5100-1CN型电子天平（Sartorius）、DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）、UV-1600PC分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）、Bio-Rad iMARK酶标仪（Bio-Rad）、KYC-100B恒温摇床（上海新苗医疗器械制造有限公司）及CF16RN型高速冷冻离心机（HITACHI）。

1.3 实验方法

1.3.1 桃胶水解液的制备

桃胶经去杂、漂洗、冷冻干燥后粉碎，过40目筛，按照料液比1∶50加入碱水解液（0.1 mol·L-1Na2CO3-NaHCO3溶液，pH=10.3），85 ℃恒温搅拌水解6 h，5 000 r·min-1离心15 min，得上清液为桃胶水解液。

1.3.2 多糖含量测定

多糖含量测定使用蒽酮比色法[11]。首先绘制葡萄糖标准曲线，将葡萄糖在105 ℃条件下烘干至恒重，配制0.1 mg·mL-1葡萄糖溶液，分别取0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL和0.5 mL葡萄糖溶液于试管中，加入蒸馏水补足至0.5 mL，之后分别加入2.5 mL蒽酮试剂，混匀后沸水浴10 min，冷却至室温。以0号作为空白对照，使用分光光度计测定其在620 nm下的吸光值。以葡萄糖含量为横坐标，吸光值为纵坐标，得到葡萄糖标准曲线。桃胶水解液中多糖含量使用相同方法测定。

1.3.3 蛋白质含量测定

蛋白质含量测定使用Bradford法。首先绘制蛋白质标准曲线，分别取1 mg·mL-1牛血清白蛋白0 μL、3 μL、6 μL、12 μL、18 μL、24 μL、30 μL和45 μL于离心管中，加入磷酸缓冲盐溶液（PBS）补足至300 μL，获得不同浓度的蛋白溶液。分别取不同浓度的蛋白溶液20 μL于酶标板中，之后每孔分别加入200 μL Bradford溶液，迅速混匀后室温静置5 min，之后在酶标仪中测量其在595 nm下的吸光值。以蛋白浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，得到蛋白质标准曲线。桃胶水解液中蛋白质含量使用相同方法测定。

1.3.4 Sevage法脱蛋白

取桃胶多糖水解液20 mL，加入1/4体积的Sevage试剂（氯仿∶正丁醇=4∶1），置于摇床中200 r·min-1振荡1 h，之后5 000 r·min-1离心10 min，弃去中间层的蛋白质和下层有机相，向上层溶液中重新加入1/4体积的Sevage试剂，重复振荡、离心操作5次。每次离心分层后吸取少量上层溶液用于测定多糖含量和蛋白质含量。

1.3.5 TCA法脱蛋白

取桃胶多糖水解液20 mL，分别加入20%浓度的TCA至终浓度为2%、4%、6%、8%和10%，置于摇床中200 r·min-1振荡1 h，之后在4 ℃条件下静置过夜，5 000 r·min-1离心10 min，取上清液用于测定多糖含量和蛋白质含量。

1.3.6 酶法脱蛋白

取桃胶多糖水解液20 mL，使用盐酸调节pH值至6.0，分别加入木瓜蛋白酶至1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%，55 ℃下酶解3 h，之后沸水浴10 min使酶灭活，冷却至室温后，5 000 r·min-1离心10 min，取上清液用于测定多糖含量和蛋白质含量。

1.3.7 盐酸法脱蛋白

取桃胶多糖水解液20 mL，分别加入1 mol·L-1盐酸至盐酸终浓度为0.2 mol·L-1、0.3 mol·L-1、0.4 mol·L-1、0.5 mol·L-1和0.6 mol·L-1，置于摇床中200 r·min-1振荡2 h，5 000 r·min-1离心10 min，取上清液用于测定多糖含量和蛋白质含量。

1.3.8 评价指标

分别计算不同脱蛋白条件下的多糖保留率和蛋白脱除率，计算公式：多糖保留率=脱蛋白后多糖含量/脱蛋白前多糖含量×100%；蛋白脱除率=（脱蛋白前蛋白质含量-脱蛋白后蛋白含量）/脱蛋白前蛋白质含量×100%。

2 结果与分析

2.1 Sevage法脱蛋白

Sevage法脱蛋白结果如图1所示，随着脱蛋白次数的增加，蛋白脱除率迅速提高，5次脱蛋白后蛋白脱除率达到91.25%，但1次（89.64%）和5次之间提高并不明显；与之相对地，多糖保留率随着脱蛋白次数的增加逐渐缓慢降低，从1次的86.71%下降至5次的77.33%。综合两个评价指标，Sevage法脱蛋白4次，整体脱蛋白效果较好，桃胶多糖的蛋白脱除率（89.64%）和多糖保留率（82.47%）都在较高水平上。

图1 Sevage法脱蛋白次数对桃胶多糖蛋白脱除率和多糖保留率的影响图

2.2 TCA法脱蛋白

TCA法脱蛋白结果如图2所示，随着TCA浓度的增加，蛋白脱除率逐渐上升，当TCA浓度为10%时，蛋白脱除率达到82.55%；与之相对的，多糖保留率随着TCA浓度的增加逐渐降低。综合两个评价指标，当TCA浓度为6%时对桃胶多糖的脱蛋白效果较好，此时蛋白脱除率为75.44%，多糖保留率为84.66%。

图2 TCA浓度对桃胶多糖蛋白脱除率和多糖保留率的影响图

2.3 酶法脱蛋白

木瓜蛋白酶法脱蛋白结果如图3所示，随着木瓜蛋白酶浓度的增加，蛋白脱除率逐步增加，但整体处在较低水平上，如酶浓度4%～6%中，蛋白脱除率的增加已趋于平缓，在6%的酶浓度时为76.4%；木瓜蛋白酶法脱蛋白中多糖保留率随着酶浓度的增加，多糖保留率逐步下降，但下降幅度并不大，整体保持在较高水平上（93.32%～85.70%）。综合两个评价指标，在木瓜蛋白酶浓度为6%时，整体脱蛋白效果较好，此时蛋白脱除率为76.4%，多糖保留率为85.7%。

图3 木瓜蛋白酶浓度对桃胶多糖蛋白脱除率和多糖保留率的影响图

2.4 盐酸法脱蛋白

盐酸法脱蛋白结果如图4所示，随着盐酸浓度的升高，蛋白脱除率逐渐升高，但整体水平并不高，盐酸浓度为0.6 mol·L-1时，蛋白脱除率为77.3%；多糖保留率随着盐酸浓度的升高逐渐降低，整体的多糖保留率水平较低（76.67%～60.17%）。综合两个评价指标，盐酸浓度为0.3 mol·L-1时，桃胶多糖脱蛋白效果较好，此时蛋白脱除率为70.04%，多糖保留率为74.12%。

图4 盐酸浓度对桃胶多糖蛋白脱除率和多糖保留率的影响图

3 结论与讨论

原桃胶经过精制后可得商品桃胶，其溶解度提高，黏度降低，在食品、化工、医药等领域广泛应用。桃胶主要成分为多糖，包括半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖和葡萄糖等，脱蛋白是提高桃胶多糖纯度和品质的重要环节。常见的脱蛋白方法包括盐析法、Sevage法、TCA法、酶法、盐酸法等，研究表明不同材料所适用的最佳脱蛋白方法并不相同。例如，李小蓉等比较了Sevage法和TCA法对倒卵叶五加多糖的脱蛋白效果，结果表明TCA用量为7.5%，TCA处理3次，处理时间为30 min时，脱蛋白效果最佳[8]；刘佳维等比较了Sevage法、TCA法和木瓜蛋白酶法对红参多糖脱蛋白工艺的效果，结果表明木瓜蛋白酶法效果最好，最佳工艺为酶用量3%，pH值6，酶解温度50 ℃，酶解时间2 h[12]；张帅等比较了Sevage法、TCA法、酶法和醋酸铅法对笋壳多糖的脱蛋白效果，结果表明笋壳多糖脱蛋白最佳方法为醋酸铅法[13]。此外，也有研究将不同脱蛋白方法联合使用，例如，王晓林等分别使用了Sevage法、TCA法、酶法、酶法+Sevage法联用和酶法+TCA法联用分析猴腿蹄盖蕨多糖的脱蛋白效果，结果表明酶法+TCA法联用的脱蛋白效果最佳[14]。但是不同材料中联合使用不同方法的效果也存在很大差别，并不是联合使用效果就会更好，例如，胡会刚等在研究芒果皮渣多糖脱蛋白工艺时，除了单独使用一种脱蛋白方法外，还使用了TCA+Sevage法、木瓜蛋白酶+TCA法、木瓜蛋白酶+Sevage法、木瓜蛋白酶+TCA-正丁醇法，结果表明单独使用TCA-正丁醇法效果最佳[9]。此外，联合使用不同方法存在步骤繁琐、多糖损失率高等缺点，因此实际生产中更多使用单一方法。

本研究以蛋白脱除率和多糖保留率为评价指标，比较了常用的脱蛋白方法对桃胶多糖的脱蛋白效果。综合比较几种脱蛋白方法，Sevage法随着脱蛋白次数的增加，蛋白脱除率迅速提高，在脱蛋白4次时效果最佳；TCA法当TCA浓度为6%时脱蛋白效果较好，当TCA浓度过高时多糖保留率下降明显；木瓜蛋白酶法条件较为温和，多糖保留率水平是几种方法中最高的，但是蛋白脱除率水平较低；盐酸法多糖保留率低于其他方法，可能是因为在此过程中糖苷键发生裂解。综合比较几种方法的蛋白脱除率和多糖保留率，Sevage法为桃胶多糖脱蛋白的最佳方法，当脱蛋白4次时，蛋白脱除率为89.64%，多糖保留率为82.47%。