畜牧场土壤中重金属与抗生素抗性基因的分布规律研究

綦峥，齐越，李芳，杨红，张铁林，凌娜

1. 哈尔滨商业大学药物工程技术研究中心，哈尔滨 150076

2. 哈尔滨海关技术中心，哈尔滨 150028

抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)在环境中的形成、传播和扩散作为一个新的全球性污染问题正在引起高度重视[1]。抗生素的广泛使用通常被认为是致病菌中ARGs水平升高的主要原因[2]。环境抗生素残留可影响动物肠道菌群[3]，显著增加细菌获得ARGs的频率，并通过基因水平转移(horizontal gene transfer, HGT)加速ARGs的传播，从而使畜禽粪便成为抗生素和ARGs的重要储存库[4-5]，然而在我国畜禽粪便利用率不足50%，含有ARGs的粪肥很容易通过各种途径进入土壤，从而威胁食物链，引起人类的健康风险，因此土壤被认为是抗生素残留和ARGs的最重要受纳体之一[6]。

近年来，使用含有重金属元素的杀虫剂和促进动物生长剂导致了更广泛的重金属非点源污染[7-8]。越来越多的报道表明，ARGs的丰度增加还可能是由于重金属的废物排放，与抗生素不同的是，重金属作为饲料添加剂广泛应用于畜牧场中，因其不易降解，在暴露的生物体中会对ARGs产生长期的选择压力，常常促进了ARGs在环境细菌种群中的传播[9]。许多试验研究表明，重金属与ARGs之间存在极大的相关性[10-11]。Ji等[12]对上海地区3个典型饲料厂采集土壤和肥料样品，发现某些ARGs与典型重金属之间存在显著的相关性(P<0.05)，如sulA和sulⅢ与Cu、Zn和Hg的浓度水平高度相关。Wang等[13]在厌氧消化过程中，研究了金霉素和Cu对ARGs的影响，结果表明，Cu对ARGs有一定的选择压力，但金霉素和Cu共同作用会对ARGs有极大的选择压力，特别是tetA和intⅠ1。Knapp等[14]检测了澳大利亚的西澳大利亚州的90个花园土壤，比较12种重金属和13种四环素、内酰胺和磺胺类AGRs的相关性，除Se和Co外，所有重金属在绝对基因数上与至少一个ARGs相关，但Al、Mn和Pb与多种ARGs的相关性显著。已有研究证实，Cu和Ni的暴露增加了土壤中ARGs的多样性和丰度[15-16]。

然而很少有研究调查大型畜牧场土壤中重金属与ARGs的关系和分布，因此本研究以杜尔伯特蒙古族自治县畜牧园区不同深度土壤为研究对象，采用地理信息系统(Geographic Information System/Geo-Information system, GIS)模型的空间分析和可视化功能模拟污染物的污染范围和趋势，以此获得ARGs与重金属在畜牧场土壤中的空间分布规律及相关性。为预测未来ARGs和重金属对北方特色黑土的污染特征提供了理论依据，并为下一步寻找有效的预防措施奠定基础，同时为相关部门提供基础数据信息以制定控制ARGs污染的监管标准和指导方针。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 样品采集

杜尔伯特蒙古族自治县是黑龙江省唯一的少数民族自治县(以下简称杜蒙)。地处松嫩平原、嫩江东岸。在地层结构上，以大型杂色砾岩块为主的第三系太康组和表层1.0 m为灰黑色腐殖土、砂砾层等的第四系组成。在中部、北部和东部地区，经常形成不同程度的盐化和碱化草甸土壤，因此，杜蒙在具有我国特色的盐碱化土地上发展畜牧业，使畜牧业成为杜蒙不可替代的支柱产业。本次研究的畜牧场面积约7万m2，奶牛约200头，是国内某知名奶业品牌奶源的提供基地。结合GIS优化布点，发现初步调查第1阶段预设采样点与第2阶段实际采样点因采样区域地貌存在些许偏差，因此10个实际土壤采样点的布设如图1所示，采样点S01～S08为成牛的自由活动区，S09和S10为犊牛的自由活动区。分别在每个采样点采集土壤表面以下10 cm和50 cm的土壤样品各500 g[17-18]。在每个采样点1 m2内采集3份土壤样品混匀，按照四分法缩减，过0.25 mm(20目)尼龙筛，共20份土壤样品。20份土壤样品分别均匀分成2部分：一部分土壤过0.15 mm(100目)筛，自然风干，用于后续重金属含量的测定；另一部分土壤过0.25 mm(60目)筛，-80 ℃保存，用于后续DNA的提取和ARGs的测定。样品的基本信息如表1所示。

表1 样品编号和精确采样经纬度

图1 采样点分布图

1.2 重金属含量的检测

土壤pH值的测定采用土壤的去CO2水悬浮液，土液比为1∶2.5，搅拌静置后用多参数测定仪测定[19]；土壤中的Cu、Zn、Pb、Ni、Cr和Cd经HNO3-HF-HClO4(体积分别为5 mL、2 mL和1 mL)石墨消解后用原子吸收光谱仪测定[20-21]；Hg和As经(1+1)王水(1份硝酸与3份盐酸混合，去离子水稀释1倍)沸水浴后用原子荧光分光光度计测定[22-23]；同时进行空白试样的制备。为保证分析的准确性，对质控样品(GBW07427)和试验样品进行平行样分析，并确定了平均值，相对标准偏差<15%。

1.3 DNA的提取

土壤基因组DNA的提取使用快速提取试剂盒TIANNAMP Soil DNA Kit(DP336，天根生化科技(北京)有限公司，中国)，按照说明书要求提取。提取完毕后，超微量紫外分光光度计(Q3000，Quawell，美国)检测含量及纯度，A260/A280在1.8～2.0之间，-80 ℃保存，进行后续定量分析。

1.4 ARGs相对丰度的实时荧光定量PCR检测

标准PCR定性检测ARGs后，采用StepOnePlusTM实时荧光定量PCR仪(Thermo，美国)对β-内酰胺类(ampC2、ampC4、blaOXA1/blaOXA30、blaOXA10、blaPSE、blaTEM、cfxA和fox5)、磺胺类(sul1、sul2和sul3)、四环素类(tet32、tet34、tet36、tetAP、tetB、tetC、tetG、tetM、tetO、tetPA、tetR、tetS、tetT、tetW、tetX、tetY和tetZ)共28种ARGs及16S rRNA进行靶向定量测定[24-25]。qPCR采用10 μL体系，包含5 μL的TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(2×)，2个引物各0.4 μL，0.2 μL的ROX Reference Dye(50×)，1 μL的DNA模板以及3 μL的ddH2O。反应体系为：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，共40个循环，△CT方法计算ARGs的相对丰度。每个样品设置3个平行样，同时做空白对照。

1.5 数据分析

采用ArcGIS 10.4.1软件绘制重金属和ARGs空间污染云图，分析重金属和ARGs垂直、水平污染空间分布特征；利用Cluster 3.0和Java Treeview软件绘制热图，对比分析重金属对ARGs的选择压力是否存在差异；采用SPSS 23.0对重金属和ARGs进行Pearson相关性分析；应用Origin 2017绘图软件进行堆积柱状图的绘制。

2 结果与讨论(Results and discussion)

2.1 不同土层中重金属污染情况及污染评价

对不同土层样品进行pH值测定，结果所有样品pH>8；对10 cm和50 cm土壤深度的Cu、Zn、Pb、Ni、Cr、Cd、Hg和As含量进行描述性分析，统计结果如表2所示。以国家土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准值(pH>7.5)为评价基准，采用单因子污染指数法[26]和内梅罗综合污染指数法[27]对杜蒙园区土壤重金属(10 cm和50 cm)污染状况进行评价，并与黑龙江省土壤重金属含量背景值进行对比。污染程度等级为：单因子污染指数Pi≤1为不存在污染；Pi≥3为重度污染，内梅罗综合指数法P综≥3为重度污染。由表2可知，检测的As、Zn、Cu、Cr、Cd、Ni、Pb和Hg这8种重金属中，As处于重度污染，其余7种重金属均为安全等级，其中，50 cm土层的As的单因子污染指数最高，达到7.74，远高于其他7种重金属。从超标率来看，10 cm和50 cm的As远远高于黑龙江土壤背景值[28]7.3 mg·kg-1和11.4 mg·kg-1，10 cm的Zn超背景值1.26倍，10 cm的Cd超背景值1.06倍，且超标率均≥60%，表明杜蒙畜牧园区土壤可能已受这3种重金属污染。内梅罗综合污染指数法的公式为：

表2 土壤重金属统计分析

式中：P综为内梅罗综合污染指数；Pi为单因子污染指数；Pimax为各重金属元素单因子污染指数的最大值；Piave为各重金属元素单因子污染指数的平均值。P综10 cm=4.608、P综50 cm=5.526，同样表明杜蒙畜牧园区土壤重金属污染已达到重度污染等级。

变异系数(coefficient of variation, CV)代表样本中重金属含量的离散性，可反映人为活动对重金属含量的影响，CV值越大，说明受人为活动的干扰越明显。Wilding[29]发现，CV<0.15为轻度变异，0.150.36为高度变异。在这8种重金属中，As、Cr和Pb的变异系数均高于0.36，说明土壤中As、Cr和Pb受外界干扰显著，空间分散程度较大，很大程度上归结为畜牧业和交通等人为活动的影响。

2.2 不同土层中重金属的空间分布特征

利用ArcGIS对土壤重金属进行反距离加权插值，绘制杜蒙畜牧园区10 cm和50 cm土壤中8种重金属空间分布云层图。由图2可知，8种重金属的分布差异较大，但仍存在一定的规律性。垂直剖面分析来看，As、Hg、Cr、Ni和Pb由上至下呈逐渐增大的污染特征，但Cu、Zn和Cd随着土壤深度的增加由上至下呈逐渐减小的污染特征，很大程度上与牧场园区使用动物生长剂有关[30]，这与阮心玲等[31]和梁玉峰等[32]研究得出的土壤中Cu、Zn和Cd更易在表层富集的结论一致。研究表明，多数重金属不仅易在表层富集，且随着土壤深度的增加会逐渐迁移及蓄积[33-34]。因此，重金属垂直分布变化的原因有待进一步的深入研究。从水平结构分析来看，As在10 cm和50 cm土层的水平结构类似，从西向东污染特征呈先增加后减小再增加的趋势，且污染主要集中于东南部地区，很大程度上与大气沉降[35]及牧场园区施用杀虫剂和除草剂等有关。Pb在10 cm和50 cm土层的水平结构类似，从西向东呈先增加再减小的趋势，且在中部地区污染最严重；Hg和Cr在10 cm土层的结构类似，主要污染特征集中在东南部，由于该地区Hg的平均含量较低，推测该分布特征与自然来源土壤母岩等有关[36]；Ni和Zn在10 cm土层的结构类似，污染特征在西部和中部聚集；As和Ni、Pb和Zn、Cu和Cr分别在50 cm土层水平结构类似，污染特征分别在东南部、中部和西部地区较高。总体来说，畜牧场重金属污染呈重度等级，很大程度上与天然矿石、大气沉降以及畜牧场的养殖模式有关。同时，重金属之间存在同源性，污染来源可能与畜牧场农业活动和土壤母质因素等有关。

图2 不同土层中重金属的空间分布图

2.3 不同土层中ARGs的空间分布特征

土壤中28种ARGs的检测结果如图3和图4所示，可以看出，各类ARGs在不同土层中的含量有较大差异。在磺胺类ARGs中，sul2的相对丰度最高，赵祥等[37]用real-time qPCR对土壤中ARGs的丰度进行检测，发现磺胺类ARGs中sul2的含量较高，与本研究结果相似。张兰河等[38]研究土壤ARGs的分布特征发现磺胺类ARGs中sul1和sul2的检出率均为100%，与本实验结果相似。同样有研究表明，磺胺甲噁唑的污染会引起土壤中磺胺抗性基因sul1的丰度显著增加且能提高sul2的丰度[39]，饲料添加剂中的磺胺脒也可能是磺胺类ARGs丰度增加的原因之一[40]。垂直方向上，磺胺类ARGs都随着土壤深度的增加呈逐渐降低的趋势，水平方向上，从西向东污染特征逐渐增大，主要污染特征集中在东部地区；β-内酰胺类ARGs中，50 cm中blaTEM的相对丰度极大，主要集中在S02～S04的成牛自由活动区和S9～S10犊牛自由活动区。这也是造成50 cm土层中ARGs明显升高的原因，但在10 cm土层中，β-内酰胺类ARGs相对丰度含量极小，且随土壤深度的增加有明显上升趋势，表明β-内酰胺类ARGs可能有垂直向下传播转移的风险，也可能是杜蒙畜牧场奶牛食用头孢类抗生素治疗奶牛乳腺炎的缘故，有研究表明，头孢菌素或重金属胁迫条件下，β-内酰胺类ARGs的相对丰度逐渐升高[41]，例如，袁晓春[42]在乳制品中检测出了头孢氨苄，含量为45.0 μg·L-1。从水平方向看，β-内酰胺类ARGs污染特征差异较大，主要集中于西部的犊牛活动区和东北部成牛活动区，推测β-内酰胺类ARGs可能在亲代和子代之间有传播转移的风险。四环素类ARGs的种类和相对丰度较高，这与Zhou等[43]研究得出的我国农田土壤ARGs的分布结果一致，说明四环素类ARGs在环境中的持久性强于磺胺类ARGs[44]，且随着土壤深度的增加有逐渐降低的趋势，其中，除tet32、tet34、tet36、tetO、tetPA和tetR外，其余四环素类ARGs的检出率均为100%，且tetAP和tetX的相对丰度较高。蒋临正等[45]的研究表明，长期使用四环素对奶牛乳房炎进行治疗会导致耐药性的增加。水平方向上，四环素类ARGs从西向东污染特征逐步增大，主要集中于东部地区。

图4 磺胺类、β-内酰胺类和四环素类ARGs在不同土层的空间分布图

图3 抗生素抗性基因(ARGs)在不同土层的相对丰度

不同奶牛场的ARGs分布特征各有不同。Liu等[46]研究美国华盛顿州中部地区6个不同的住房区域奶牛场粪便和土壤的ARGs分布时，发现犊牛区域的土壤ARGs最高，特别是rmtC和fosA3。与本研究犊牛自由活动区的土壤中所含blaTEM较高的结果有明显差异。Zhou等[47]研究了中国山西省17个奶牛场的ARGs的分布，发现土壤中的四环素类ARGs>磺胺类ARGs>β-内酰胺类ARGs，与本研究中β-内酰胺类ARGs的相对丰度最高的结论相反。Sun等[48]对中国南京市郊区的7个奶牛场的土壤调查发现，sul1和sul2在每一个奶牛场的检出率均为100%，且相对丰度范围为4.5×10-7～5.5×10-4拷贝数/16S rRNA基因拷贝数，远远小于本研究结果中磺胺类ARGs的相对丰度。以上不一致的研究结果表明，ARGs差异较大的原因可能与不同区域的土壤理化性质、历史抗生素使用背景及重金属、细菌群落等其他因素有关[49-52]。

2.4 重金属与ARGs的相关性分析

重金属与ARGs的相关性分析如表3所示，在P<0.05水平上，Cr与sul2、tetX和As与tetR呈中度正相关(r>0.5)；Pb与tetW呈低度正相关(r=0.495)；Cd与tetC呈低度正相关(r=0.463)，但在P<0.01水平上，Cd与tet34呈中度负相关(r=-0.590)；总体而言，重金属As对总四环素类ARGs呈低度正相关(r=0.469，P=0.037)，其他重金属与ARGs之间则没有较明显的相关性。事实上，在某些情况下，重金属可能比特定的抗生素对ARGs更有选择性[12]。而对于重金属与ARGs之间关系的研究，不同研究者得到的结论也不尽相同。Zhao等[53]对英国北爱尔兰地区受金属污染的城市土壤金属含量和ARGs进行相关性分析，发现24种金属与ARGs呈显著正相关，其中，Cr、Zn与β-内酰胺类ARGs显著相关。Deng等[54]研究重金属、抗生素和营养物质影响施肥土壤中ARGs的结果表明，Cu与ARGs呈显著正相关。Knapp等[55]对英国苏格兰土壤重金属和ARGs的关系进行定量研究，发现许多ARGs与Cu呈正相关，而Cr、Ni、Pb和Fe也与特定的ARGs显著相关。而Ding等[56]的研究结果表明，当Zn或Cu与土霉素同时存在时会对ARGs产生很强的协同作用。因此重金属对土壤中ARGs有潜在的影响，但多种因素联合发挥作用往往是造成重金属对ARGs的选择差异的原因。

表3 重金属与ARGs相对丰度的相关性

通过聚类分析，进一步分析重金属与ARGs的关系，如图5所示，热图的横向代表ARGs的相对丰度，纵向代表8种重金属的聚类情况，可反映出重金属对ARGs是否有选择压力的相似性，由图5可知，重金属污染程度较重的As和Cr可以聚类，污染程度一般的Cd、Zn和Cu可以聚类，污染程度较轻的Hg、Ni和Pb可以聚类。这表明，As和Cr对ARGs的选择压力相似，Cd、Zn和Cu对ARGs的选择压力相似，Hg、Ni和Pb对ARGs的选择压力相似。

图5 重金属与ARGs的聚类分析

综上所述，本研究结果表明：

(1)杜蒙畜牧园区不同土层重金属污染严重，内梅罗综合污染指数等级为重度污染，其中As污染最为严重，单因子污染指数为重度污染等级(Pi>3)，其他7种元素属于安全等级(Pi≤1)。

(2)杜蒙畜牧园区空间污染分布云层图显示重金属As由上至下呈逐渐增加的垂直污染，而Cu、Zn和Cd更易在表层富集，污染主要集中于东南部地区。

(3)ARGs污染特征明显，在不同土层中的相对丰度有较大差异，其中，blaTEM在50 cm的土层污染较为严重，主要集中于西部和东南部地区。

(4)杜蒙畜牧园区土壤中个别四环素类ARGs和磺胺类ARGs相对丰度与重金属As、Pb、Cd和Cr存在不同程度的相关性，同时重金属污染程度较重的As和Cr对ARGs的选择压力相似。