不同污染方式进入土壤的氯氰菊酯在蚯蚓体内的蓄积特征及其生长毒性

熊张平，周世萍，解思达，郭佳葳，李惠娟，陈修才

西南地区林业生物质资源高效利用国家林业与草原局重点实验室(西南林业大学)，昆明 650224

氯氰菊酯是拟除虫菊酯类农药的重要品种，也是目前我国广泛使用且污染最为严重的拟除虫菊酯类农药品种之一[1-4]。刘航[1]对2013—2016年我国辽宁省蔬菜安全状况进行了调查，发现蔬菜中氯氰菊酯农药超标严重。近5年研究者对我国云南省昆明市晋宁区等主要蔬菜和花卉产区的农药残留调查发现，农田土壤中氯氰菊酯的残留检出率相对较高。氯氰菊酯为非极性杀虫剂，易被土壤吸附并固定，土壤是氯氰菊酯在环境中的主要归宿[5-7]。蚯蚓作为土壤动物区系的代表类群，利用蚯蚓作为土壤环境的指示生物，可以提供保护整个土壤动物区系的安全域值，评价污染物可能对环境的危害程度，从而对其可能导致的生态风险进行监测管理[8-12]。

一次污染是利用蚯蚓作为指示生物，研究农药污染物可能导致的生态风险常用的污染方式。这种污染方式是在供试土壤中一次性加入污染物，使其土壤浓度达到实验设计浓度。多次叠加污染是采用低剂量多次叠加的方式加入实验农药，使其土壤最终叠加浓度达到所需设计浓度。以不同污染方式进入土壤的农药可能因降解变化，导致其生物可利用性变化，从而影响其生物毒性。与一次污染方式相比，低剂量多次叠加的方式更接近实际土壤环境中农药低剂量多次施用逐步累积的污染过程，而目前已有的以蚯蚓作为研究生物对氯氰菊酯生态风险的研究均是基于一次污染方式[13-15]，缺乏叠加污染条件下的基础研究，污染方式是否影响氯氰菊酯对蚯蚓的生物毒性及生态风险评价，是过去研究中尚未明确的问题。

为此，本研究选择云南耕地常见的本地种蚯蚓——皮质远盲蚓为研究对象，分别采用高剂量一次污染与低剂量多次叠加污染的方式，模拟氯氰菊酯进入土壤的过程，从蚯蚓对氯氰菊酯的吸收蓄积入手，研究不同污染方式条件下，蚯蚓对氯氰菊酯的生物富集变化规律以及氯氰菊酯蓄积对其生长影响，为土壤农药叠加污染累积的生态风险评价及防治，提供基础数据和理论依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 供试材料

供试农药：氯氰菊酯标准品(纯度>98%)购自美国Sigma公司。

供试土壤：土壤采自昆明市西南林业大学实验地2～15 cm耕作层。采用对角线取样法，于5个采样点分别采取质量相等的土样后，充分混合得到实验用土壤。土样风干后过1 mm筛备用。土壤类型为红壤，阳离子交换量为10.1 cmol·kg-1，质地为粘壤土，pH为6.55，有机质含量为17.86 g·kg-1，土壤经分析未检出氯氰菊酯。

供试生物为云南红河地区采集的皮质远盲蚓，培养条件为：温度控制20 ℃，自然光照，土壤含水量为田间最大持水量50%。实验蚯蚓选用2～3月龄，体质量0.4～0.5 g，具有成熟环带的健康蚯蚓。实验前将蚯蚓在供试土壤中适应1周后取出，用纯水冲洗放入铺有湿润灭菌纱布的玻璃皿中，恒温(20 ℃)暗室培养24 h，进行清肠处理备用。

1.2 蚯蚓对土壤氯氰菊酯的生物富集实验

本研究分别采用一次添加和多次叠加的污染染毒方式进行生物富集实验。一次添加是指在供试土壤中一次性加入氯氰菊酯，使其土壤浓度达到实验所需设计浓度；多次叠加污染则是采用低剂量多次叠加的方式加入氯氰菊酯，使其土壤最终叠加浓度达到所需设计浓度。按照氯氰菊酯10%乳油防治蚜虫和红铃虫等虫害常用的田间单次最大施用剂量(90 g·hm-2)施用时，测得土壤氯氰菊酯原始沉积量为(1.71±0.31) mg·kg-1，考虑到实际防治中氯氰菊酯的施用次数一般为2～3次，每次间隔期为7 d。因此，叠加实验的单次叠加剂量设置为2.0 mg·kg-1，叠加间隔时间设置为7 d，叠加次数分别设置为2次和3次。

为便于比较研究，一次添加污染的生物富集实验中，氯氰菊酯实验浓度与2次和3次的叠加总浓度相同，分别为4 mg·kg-1和6 mg·kg-1。根据土壤氯氰菊酯设计浓度计算氯氰菊酯需要量，以丙酮溶解后搅拌混匀于20 g土壤中，待丙酮完全挥发后再与480 g土壤混匀，放入500 mL培养瓶内，加入蒸馏水将土壤含水量调节为土壤田间最大持水量的50%。

将清肠处理后的蚯蚓随机放入对照组和处理组，每瓶放入20条蚯蚓，以保鲜膜封口(预留换气孔)。在湿度为50%、温度为20 ℃的条件下培养，每隔7 d给予5 g磨碎的干牛粪作为饵料，以丙酮空白为对照组，每个浓度及对照设3个重复。

多次叠加污染的生物富集实验，叠加总浓度与一次污染浓度相同，但需要进行分次叠加，各次叠加剂量均为2 mg·kg-1，叠加次数分别设置为2次和3次，叠加间隔时间为7 d，其余处理条件均与一次污染相同。每次叠加时，先将蚯蚓与土壤分离，将蚯蚓置于暗处湿润滤纸上，取出实验土壤20 g，将叠加所需的氯氰菊酯用丙酮溶解后，拌于取出的土壤中，待丙酮完全挥发后(无丙酮气味)再与其剩余土壤混匀后，再将蚯蚓放入各实验土壤。叠加全部完成后土壤氯氰菊酯叠加总浓度分别为4 mg·kg-1和6 mg·kg-1，与一次添加污染方式处理的氯氰菊酯实验浓度相同。

1.3 样品测定

在21 d叠加污染实验完成后采样，分别于生物富集实验第21、28、35、45和55天，对处理组和对照组进行取样，各平行组采取2条蚯蚓和10.0 g土壤，将蚯蚓用去离子水洗净、清肠、准确称重，分别测定土壤样品中氯氰菊酯的残留量、蚯蚓体内氯氰菊酯蓄积量和蚯蚓脂肪质量分数(%) (flipid)。根据测定数据计算生物-土壤蓄积因子(FBSA)，计算公式为：

(1)

式中：cew为蚯蚓体内氯氰菊酯含量(mg·kg-1)；cs为土壤中氯氰菊酯含量(mg·kg-1)；flipid为蚯蚓脂肪质量分数(%)；foc为土壤有机质含量(g·kg-1)

脂肪含量测定参照文献[16]。将蚯蚓清肠24 h后准确称量体质量(mo)，放入预先称量质量(m1)的离心管中，加入10 mL的甲醇-氯仿溶剂(1∶1，V/V)匀浆后超声处理5 min，平衡4 h后离心10 min(8 000 r·min-1)，收集上清液于50 ℃干燥后准确称量(m2)。根据测定数据计算蚯蚓脂肪含量，计算公式为：

(2)

蚯蚓氯氰菊酯蓄积量测定方法如下。将蚯蚓用去离子水洗净、清肠，准确称重后置于10 mL聚丙烯离心管中，加入石油醚1 mL，采用电动玻璃匀浆机匀浆3 min后以4 000 r·min-1离心10 min，将上清液转入另一离心管中，再加入5 mL石油醚继续离心10 min，合并2次上清液为提取液。在净化柱底端装入处理脱脂棉，依次加入5.0 g无水硫酸钠，3.0 g弗罗里硅土，5.0 g无水硫酸钠，用2 mL石油醚预淋洗后加入提取液过柱，分别用10 mL洗脱液淋洗2次后收集淋洗液，在旋转蒸发仪(30 ℃水浴)浓缩近干。用石油醚充分溶解并定容至1 mL，进行气相色谱(GC)测定。检测条件：色谱柱为DM-1石英毛细管柱(30 m×0.25 m×0.25 μm)；检测器温度为320 ℃；进样口温度为280 ℃；柱温度的升温程序为200 ℃(0.75 min)，285 ℃(10 min)；氮气流速为40 mL·min-1。

土壤中氯氰菊酯残留量测定方法如下。将所取土壤置于三角瓶中，加入40 mL丙酮-石油醚(1∶1，V/V)提取液于30 ℃水浴恒温振荡2 h后过滤，用5 mL提取液洗涤滤渣3次，合并滤液于分液漏斗中，加入12% NaCl 20 mL，用20 mL石油醚萃取3次后，收集并合并石油醚相经无水硫酸钠除水后在旋转蒸发仪上(30 ℃水浴)减压浓缩近干。用1 mL石油醚定容，进行GC测定，测定条件同上。对测定数据拟合得出氯氰菊酯在土壤中的降解方程：

ct=c0×e-kt

(3)

式中：c0为氯氰菊酯初始浓度(mg·kg-1)；ct为时间t时土壤中氯氰菊酯残留量(mg·kg-1)；t为降解时间(d)；k为降解常数；e为自然常数。

1.4 质量控制与数据分析

在样品分析过程中采用方法空白、平行样(每个试验组设置3个平行)以及加标回收率测定进行质量控制。在土壤和蚯蚓样品中分别添加氯氰菊酯标样，采用1.2部分测定方法测定回收率。土壤样品的加标回收率为91.5%～105.2%，蚯蚓样品的加标回收率为90.1%～106.2%。所有统计均采用SPSS22.0和Origin Pro8.0软件完成。应用单变量多因素方差分析确定暴露浓度、暴露时间和染毒方式及其共同作用对蚯蚓生物富集和生长影响；不同浓度处理组之间采用单因素ANOVA进行多重比较分析(LSD)。

2 结果(Results)

2.1 不同污染方式进入土壤的氯氰菊酯残留动态

对以一次添加和多次叠加污染方式进入土壤的氯氰菊酯残留量的测定数据进行拟合，得到的模型参数如表1所示。由表1可知，不同污染方式进入土壤的氯氰菊酯在土壤中的降解动态均符合一级动力学模型，一次污染条件下，氯氰菊酯在土壤中的降解半衰期分别为27.7 d(4 mg·kg-1)和28.9 d(6 mg·kg-1)；叠加污染条件下，氯氰菊酯在土壤中的降解半衰期分别为25.7 d(4 mg·kg-1，2次叠加)、26.6 d(6 mg·kg-1，3次叠加)。相同实验浓度条件下，与叠加污染方式相比，以一次污染方式进入土壤的氯氰菊酯在土壤中的降解相对缓慢。

表1 不同污染方式进入土壤的氯氰菊酯降解参数

2.2 蚯蚓对不同污染方式进入土壤的氯氰菊酯蓄积

空白对照组的蚯蚓体内均未检出氯氰菊酯，蚯蚓对不同方式进入土壤的氯氰菊酯吸收蓄积量变化如图1所示，暴露21 d时，蚯蚓对以一次污染方式进入土壤的不同浓度氯氰菊酯蓄积量均达到最大，不同浓度处理组蚯蚓体内氯氰菊酯的蓄积量差异显著(P<0.05)；随着暴露时间延长，蚯蚓体内氯氰菊酯蓄积量持续下降，暴露35～55 d，各浓度处理组蚯蚓的氯氰菊酯蓄积量已基本稳定，同一浓度处理组蚯蚓暴露35 d和55 d后，体内氯氰菊酯蓄积量并无显著差异性(P>0.05)。

如图1所示，蚯蚓对叠加污染方式进入土壤的氯氰菊酯蓄积量与叠加次数、暴露时间相关。实验暴露期间，不同叠加次数处理组中，蚯蚓体内的氯氰菊酯蓄积量均随暴露时间增加而缓慢上升，但相同叠加次数处理组中，不同暴露时间的蚯蚓氯氰菊酯蓄积量差异不显著(P>0.05)。随着叠加次数增加，蚯蚓体内的氯氰菊酯蓄积量不断升高，不同叠加处理组间蚯蚓的氯氰菊酯蓄积量差异显著(P>0.05)。

图1 不同污染方式处理组中蚯蚓体内氯氰菊酯含量

暴露35 d后，相同实验浓度条件下，蚯蚓对叠加污染方式进入土壤的氯氰菊酯蓄积量均显著高于一次污染方式(P<0.05)。与一次污染方式比较，蚯蚓更容易吸收蓄积以叠加方式进入土壤的氯氰菊酯。

2.3 蚯蚓对不同污染方式进入土壤的氯氰菊酯生物富集特征

蚯蚓脂肪质量分数为(3.55±0.31)%(以干质量计)，并结合生物富集实验中蚯蚓体内氯氰菊酯蓄积量及土壤中氯氰菊酯残留量的测定数据，计算皮质远盲蚓-土壤蓄积因子(FBSA)，结果如表2所示，暴露21～28 d，蚯蚓对一次污染方式进入土壤的不同浓度氯氰菊酯的FBSA均缓慢上升；28 d时FBSA达到最大，但暴露35 d后，不同浓度处理组的FBSA持续下降并逐渐趋于稳定。氯氰菊酯以叠加污染方式进入土壤时，不同叠加次数处理组中蚯蚓对土壤中氯氰菊酯的富集程度在整个实验暴露期间(0～55 d)一直在持续增加，表现为FBSA的不断上升，暴露35 d后，不同叠加次数处理组中FBSA均高于同一实验浓度的一次污染处理组。

表2 蚯蚓对土壤氯氰菊酯的蓄积因子(FBSA)

2.4 不同污染方式进入土壤的氯氰菊酯暴露对蚯蚓生长影响

不同污染方式处理条件下，氯氰菊酯暴露对蚯蚓生长的影响如图2所示，氯氰菊酯实验浓度为4 mg·kg-1，暴露21～55 d，不同污染方式处理组中蚯蚓的体质量与对照组差异并不显著；氯氰菊酯实验浓度为6 mg·kg-1，暴露21～28 d，不同污染方式处理组中蚯蚓的体质量显著低于对照组(P<0.05)，但随着暴露时间的增加，一次污染处理组中蚯蚓的体质量逐渐恢复，暴露35 d后已逐渐恢复至对照水平，而叠加污染处理组中蚯蚓的体质量在实验暴露期间(21～55 d)均持续缓慢下降，显著低于对照组(P<0.05)。氯氰菊酯对蚯蚓的生长影响与实验浓度、暴露时间及进入土壤的方式有关(P<0.05)。

图2 不同污染方式进入土壤的氯氰菊酯对蚯蚓生长的影响

3 讨论(Discussion)

本研究采用一次和叠加2种污染方式，研究不同污染方式进入土壤的氯氰菊酯在土壤中的降解特征，以及皮质远盲蚓对其生物富集的动态变化和蚯蚓生长所受影响。研究发现，以一次污染方式进入土壤的氯氰菊酯在土壤中的降解半衰期为27.7～28.9 d(表1)，低于报道的氯氰菊酯在土壤中的降解半衰期31.5 d[17]。氯氰菊酯为非极性杀虫剂，在土壤中的降解是以微生物降解为主，化学降解为辅，土壤间理化性质的不同对其降解速率没有明显影响[18]。氯氰菊酯在土壤中降解加快的原因可能与蚯蚓的生物活动有关。有研究表明，蚯蚓可以通过吞食作用，在蚯蚓砂囊的机械研磨和消化道分泌酶联合作用下，将有机污染物转化为易于同化的碳水化合物，与土壤微生物协同作用加速对污染物的分解[19-21]，同时本实验定期投放磨碎的干牛粪作为蚯蚓饵料，干牛粪富含粗蛋白等有机质，牛粪的添加也有利于土壤微生物的活动，因此，推断氯氰菊酯在土壤中降解加快的原因是由于蚯蚓和土壤微生物对氯氰菊酯降解的协同作用。

与一次污染方式相比，相同实验浓度条件下，以叠加污染方式进入土壤的氯氰菊酯在土壤中的降解相对较快(表1)，降解加快的原因可能与土壤微生物的诱导作用有关。有研究表明，农药重复使用会对土壤微生物产生诱导作用，使其在土壤中的降解加快[22]。叠加污染的氯氰菊酯是以小剂量、多次叠加的方式进入土壤，随着叠加次数的增加，对土壤微生物的诱导作用增强，有利于氯氰菊酯的降解，因此以叠加方式进入土壤的氯氰菊酯降解较一次污染加快。

研究发现，蚯蚓对不同污染方式进入土壤的氯氰菊酯吸收蓄积并不一致。相同实验浓度条件下，蚯蚓对叠加污染方式进入土壤的氯氰菊酯蓄积量显著高于一次污染方式(P<0.05)。与一次污染方式比较，蚯蚓更容易吸收蓄积以叠加方式进入土壤的氯氰菊酯(表2)。蚯蚓对不同污染方式进入土壤的氯氰菊酯蓄积差异可能与进入土壤的氯氰菊酯老化过程有关。老化是指污染物进入土壤后，土壤会对污染物发生吸附，吸附由最初的快速可逆吸附逐渐演变为长期慢吸附的过程[23]。污染物老化后，很难再发生解吸而残留在土壤中，从而降低了污染物的生物有效性。污染物疏水性越强，与土壤接触时间越长，其在土壤中的老化程度越大。研究表明，污染物老化程度越严重，越难被生物吸收[24-27]。如蚯蚓对新鲜土壤中莠去津、异丙隆和麦草畏等3种农药的吸收蓄积量是老化土壤的2倍～10倍[28]。氯氰菊酯具有较强的疏水性[29]，与小剂量(2 mg·kg-1)多次叠加进入土壤的叠加污染方式相比，相同实验浓度的氯氰菊酯以一次污染方式进入土壤时，和土壤接触时间大于叠加污染，进入土壤的氯氰菊酯相对容易老化，蚯蚓难以对其吸收蓄积，导致蚯蚓体内氯氰菊酯蓄积量低于叠加污染的蓄积量。

FBSA是表征生物有机体在生长发育过程中，直接从土壤或从所消耗的食物中吸收并蓄积外来物质程度的参数[30]。氯氰菊酯以叠加污染方式进入土壤时，不同叠加次数处理组中蚯蚓对土壤中氯氰菊酯的富集程度在整个实验暴露期间(0～55 d)一直在持续增加，表现为FBSA的不断上升，暴露35 d后，不同叠加次数处理组中FBSA均高于同一实验浓度的一次污染处理组，与蚯蚓体内氯氰菊酯的蓄积量变化一致(表3)。

污染环境中，蚯蚓可以通过减缓生长，减少对外源污染物的摄入实现自我保护[31]。在本研究中，笔者发现氯氰菊酯对蚯蚓的生长毒性与其实验浓度及进入土壤的方式有关。当以一次或叠加污染方式进入土壤的氯氰菊酯处理浓度为4 mg·kg-1时，氯氰菊酯对蚯蚓生长均无明显抑制，说明蚯蚓对低剂量的氯氰菊酯具有一定耐受性，而随着氯氰菊酯实验浓度增加，当氯氰菊酯实验浓度为6 mg·kg-1时，暴露21～28 d，与对照组相比，一次和叠加处理组中蚯蚓均表现出显著的生长抑制(P<0.05)，说明高浓度处理促进了蚯蚓对氯氰菊酯的吸收蓄积，当蓄积量超过了蚯蚓对氯氰菊酯的耐受性后，表现出对蚯蚓的生长毒性抑制。随着暴露时间增加，由于不同污染方式进入土壤的氯氰菊酯老化差异，一次污染处理组中，蚯蚓对老化的氯氰菊酯吸收困难，导致其氯氰菊酯蓄积量下降，对蚯蚓的生长毒性减弱，暴露35 d后，蚯蚓体质量已逐渐恢复至对照水平，而叠加污染处理组中，蚯蚓的氯氰菊酯蓄积量和FBSA均显著高于一次污染处理组，说明以叠加污染方式进入土壤的氯氰菊酯，更有利于蚯蚓对其进行生物富集，从而表现出较强的生长毒性。

研究发现，以不同方式(一次或多次叠加)进入土壤的氯氰菊酯，在土壤中的降解及其影响(蚯蚓)并不相同。与一次污染比较，以叠加方式进入土壤的氯氰菊酯，虽然在土壤中的降解速率加快，有利于其在土壤中的降解，但由于老化程度降低，也有利于蚯蚓对其进行生物富集，从而表现出较强的生物毒性。以叠加方式进入土壤的农药污染物，是否会加剧对土壤生物的生态风险，还需要进行深入研究。目前，在农业生产中，氯氰菊酯等多数农药的施用多为重复多次施用，实际土壤环境中的农药污染，多为其低剂量多次施用逐步累积的污染结果。因此，在对土壤农药污染的生态风险监测及评价中，应重视其叠加污染对土壤生物的风险研究。