两性离子多肽改善GLP-1生物活性的粗粒化分子模拟

滕家曼， 刘玉婷， 朱国梁， 谌庄琳， 陈彦涛

（深圳大学化学与环境工程学院，深圳市环境化学与生态修复重点实验室，广东 深圳 518071）

蛋白药物具有生物活性高、特异性强及毒副作用小等优点，但在临床应用过程中也遇到了一系列问题[1]。比如蛋白药物通常热稳定性差，需要同时面对肾脏过滤及蛋白酶解作用，导致药代动力学严重低于预期。作为一种提升蛋白药物体内半衰期的修饰方法，利用共价键在蛋白质表面缀合高分子长链，有效推动了医药产业的发展[2]。蛋白质-聚乙二醇（PEG）偶联物是目前最成功的偶联物形式，其PEG长链以无规线团的形式把目标蛋白包覆、保护起来，将其体内循环半衰期成功延长10～100倍[3]。目前已有十几种蛋白-PEG偶联物作为长效药物获得了上市批准，被应用于糖尿病、肝炎等重大恶疾的临床治疗[4]。然而，PEG自身不可生物降解，易在肾脏中聚集，长期给药易导致免疫应答甚至较高的肝脏脂肪含量[5]。利用化学或生物手段，寻找具有低免疫原性、可生物降解的PEG替代物是目前该领域亟待解决的难点[6,7]。

作为一种潜在的PEG替代物，两性离子多肽（ZIPP）近年来获得了极大关注。ZIPP保持了多肽链的先天优势，如可生物降解、可序列设计等。另一方面，与两性离子聚合物类似[8]，ZIPP在序列中含有等物质的量之比的阳离子残基（如赖氨酸）和阴离子残基（如谷氨酸），空间上近邻的正负电荷赋予ZIPP优良的亲水性、抗吸附特性及“隐身”能力，有效延长了在血浆中的停留时间[9]。Jiang课题组首先揭示了以赖氨酸和谷氨酸为重复单元的聚多肽poly（KE）有着最强的抗吸附能力[10]；poly（KE）与内酰胺酶形成偶联物后，环境耐受性及催化活性都得到大幅度提高[11,12]。2019年，Chilkoti课题组[13]利用类弹性蛋白聚多肽（ELP）修饰胰高血糖素样肽GLP-1后，体内半衰期延长了71倍；对ELP序列进行突变，获得两性离子多肽ZIPP，其偶联物生物活性再次提高1.7倍，体内半衰期由5～6 h延长到12 h[13]。现有的偶联物构效关系认为[3]，长链高分子具有无规线团构象，其把目标蛋白包覆起来后，有效避免了肾脏清除和酶解作用，但也阻碍了目标蛋白与其受体的有效结合。Chilkoti课题组[13]的实验研究说明，在相同分子量或类似空间尺寸情况下，两性离子特性也能够提高偶联物药效动力学特性。受限于仪器分辨率，相关实验研究仍然停留在宏观或介观层面，尚不能在分子层面上给出结构与功能的关系。

本文借助于分子模拟手段，以GLP-1蛋白为研究对象，试图在微观层面揭示出两性离子多肽与GLP-1蛋白的相互作用模式，探究ZIPP与普通多肽（如ELP）在物理化学性质上的差异。一般来说，蛋白偶联物的药代动力学行为受到多重因素的影响，如高分子链的链长、序列差异及接枝位点等。已有模拟研究中，乙二醇寡聚物，而非长链高分子，被成功用来探究PEG与目标蛋白的相互作用模式[14,15]，这有效避免了其他因素对研究对象的干扰。考虑到两性离子长链多肽也呈无规线团状构象[13]，本文采取了类似的策略，利用五肽与GLP-1蛋白的混合体系，试图研究ZIPP五肽与GLP-1的相互作用模式。研究结果显示，3种五肽都能够有效稳定GLP-1蛋白的螺旋构象；尤其是含有赖氨酸和谷氨酸的ZIPP五肽，其适当的疏水性和静电相互作用，既能够有效保护GLP-1蛋白，也不易被其他物质识别而表现出“隐身”特性。

1 模型及方法

1.1 序列及结构信息

本文研究对象GLP-1及五肽的序列信息参考了Chilkoti课题组[13]的相关实验研究。GLP-1的氨基酸序列为AAHGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGAG，是内源性GLP-1的突变体，在体内有着更高的稳定性。3种五肽序列为：VPGAG、VPKEG和VPREG，文中分别简写为GA-pep、KE-pep和RE-pep。其中，GA-pep可以认为是类弹性蛋白多肽（ELP）的充分单元，而KE-pep和RE-pep是两性离子多肽（ZIPP）。

研究对象GLP-1及五肽的初始结构由Chimera软件[16]生成。GLP-1被设置为α-螺旋结构，肽平面二面角夹角分别为：Φ= 57°,Ψ= 47°；3种五肽被设置为β-片层结构，肽平面二面角夹角分别为：Φ= 139°,Ψ= 135°。为避免链末端的电荷影响，五肽N端和C端分别被乙酰基和酰胺基封端。

本文以GLP-1与五肽的混合体系为主要研究对象，分别称为GLP@GA、GLP@KE、GLP@RE。体系中GLP-1的浓度为7.9 mol/L，GLP-1与五肽的物质的量之比为1∶40。作为对照组，本文也对不含五肽的GLP-1水溶液进行了模拟，该体系简称为GLP@WAT。

1.2 粗粒化力场

考虑到GLP-1与五肽的混合物体系较为庞大，本文使用粗粒化力场PACE（ver 1.3）[17,18]加速模拟进程。PACE力场由吴云东院士及韩伟教授主导开发，其忽略了蛋白质中的非极性氢，但是保留了蛋白质的大部分原子细节，同时对水分子进行了粗粒化处理。其势能函数（E）表示如下：

式中的能量项既考虑了残基间的近程相互作用（Ebond表 示与键长有关的能量，Eangle表示与键角有关的能量，Edihedral和Eimproper表示与二面角有关的能量，Eϕ,ψ,χ1表示与旋转偏差有关的能量）；同时也包含了残基间远程相互作用，如Epolar表 示的极性库仑相互作用和Enon−polar表 示的非极性范德华相互作用；此外，还囊括了ECGW−CGW表示的粗粒化水分子（CGW）之间的非共价相互作用，以及ECGW−UA表示的水与残基之间的非共价相互作用。到目前为止，PACE粗粒化模型已被成功应用于对蛋白质折叠、多肽自组装、蛋白-多肽相互作用的研究[19]。

1.3 分子模拟流程

本工作的所有模拟都基于GROMACS软件包（ver 2018.1）[20]来进行。在210 nm3的立方盒子内，先把GLP-1蛋白放置于中央，将40条五肽随机插入到盒子内，继续加入钠离子和氯离子使得体系整体呈电中性，并设置NaCl最终浓度为0.1 mol/L。盒子中充满水分子，且所有原子的运动符合周期性边界条件。

正式的分子模拟可分为3个阶段：能量最小化、热力学弛豫及成品模拟。在能量最小化阶段，利用最速下降法对模拟体系进行5000步的能量优化。在热力学弛豫阶段，将模拟体系温度从100 K缓慢升到310 K，模拟步长设置为2 fs，该过程持续500 ps，并对蛋白质进行位置限制，力常数设置为1000 kJ/nm，且体系体积保持不变。在成品模拟阶段，将体系放置在恒温恒压系综中进行模拟，系统温度和压力分别保持在310 K和0.1 MPa，模拟步长为5 fs，该过程持续1000 ns。

在模拟运行过程中，每10步更新一次近邻列表，短程近邻列表的阈值为1.2 nm。非键范德华相互作用及长程静电相互作用的阈值为1.2 nm，相对介电常数设为15。利用Nose-Hoover方法及Parrinello-Rahman方法维持体系的温度和压力在设定值，耦合时间常数分别为1.0 ps和2.0 ps。

本研究中的4个模拟体系各进行了2次分子动力学模拟，总模拟时间超过8000 ns。

1.4 数据分析

成品模拟的最后200 ns的模拟被用来开展数据分析。利用VMD软件[21]的Timeline模块获得蛋白质二级结构的时间演化趋势；利用GROMACS的聚类函数获取模拟体系的典型构象，进一步使用PyMol软件[22]对构象进行渲染；利用GROMACS软件自带的分析模块获取体系的径向分布函数（RDF）、原子接触（Atomic contact）、GLP-1蛋白的位置涨落（RMSF）、均方位移（MSD）及末端距（Distance）。GLP-1蛋白的末端距定义为N端α碳与C端α碳之间的距离。参考文献[19]，当氨基N原子与羰基O原子之间距离小于0.32 nm时，定义为发生静电相互作用；当残基原子与水原子之间的距离小于0.5 nm时，定义为发生了原子接触。

2 结果与讨论

2.1 GLP-1蛋白的二级结构演化情况

已有研究显示，游离态的GLP-1蛋白不具有稳定的二级结构[23]；而GLP-1蛋白与受体结合后，以长螺旋的形式存在[24]。在五肽存在的情况下，GLP-1蛋白空间构象如何变化，至今未有相关的实验研究。本研究中，GLP-1蛋白和五肽的初始构象分别被设定为α-螺旋和β-片层结构。由图1（a）可知，模拟开始后，游离GLP-1的构象变得非常不稳定，初始螺旋结构被分子热运行迅速破坏。由图1（b, c, d）可知，体系中引入40条五肽后，GLP-1蛋白的螺旋结构得以稳定；尤其在GLP@RE体系中，除2个末端外，GLP-1整体呈现长螺旋结构。

图1 各模拟体系中GLP-1蛋白的二级结构随时间的变化情况Fig. 1 Time evaluation of the secondary structures for GLP-1 protein in different simulated systems

为定量观察体系的演化情况，本研究统计了混合体系中五肽与水的接触数。如图2（a）所示，接触数在前100 ns内快速下降，这说明五肽分子能够在短时间内调整空间分布。五肽与GLP-1的接触数（见图2（b））呈现出较大的涨落，但250 ns以后围绕平均值周期性变动，说明整个模拟体系基本到达热力学平衡态。在3个混合物体系中，GA-pep与水形成了最少的接触数，这说明GA-pep具有较强的疏水性，形成了较为致密的聚集体，同时与GLP-1蛋白形成了最多的接触数。KE-pep和RE-pep等两性离子多肽具有一定的亲水性，形成了的聚集体较为疏松；相较而言，KE-pep形成的聚集体最为疏松，与GLP-1蛋白形成了最少的接触数。

图2 各模拟体系中五肽的原子接触数（Atomic contact）随时间的变化情况：（a）五肽与水溶剂的接触数；（b）五肽与GLP-1蛋白的接触数Fig. 2 Time evaluation of the atomic contacts for pentapeptides with （a） water and （b） GLP-1 protein in different simulated systems

2.2 GLP-1蛋白在室温下的典型构象

模拟体系进入平衡态后，本研究进一步统计了GLP-1蛋白的末端距及二级结构分布。如图3所示，游离GLP-1蛋白的螺旋比例仅为30.8%，其末端距也最小（0.67 nm）；在得到五肽保护后，其螺旋比例则明显提高。相比GA-pep，ZIPP更有利于GLP-1形成螺旋构象；特别是在GLP@KE体系中，螺旋比例增加到60.4%，近乎是GLP@WAT体系的2倍。图4给出了GLP-1在不同体系中的典型构象。游离GLP-1蛋白的整体构象呈现为无规线团，N端与C端相互靠拢，呈闭环状，并形成少量β-片（见图1（a））。引入五肽后，GLP-1蛋白的两个末端被迫分开，增强了形成螺旋的概率；尤其是在GLP@RE体系中，GLP-1形成了单根长螺旋。而在GLP@GA和GLP@KE体系中，GLP-1蛋白形成了多个短螺旋。

图3 热力学平衡后，各模拟体系中GLP-1蛋白的（a）二级结构分布及（b）末端距Fig. 3 （a） Distribution of secondary structures and （b） end-to-end distance of GLP-1 protein in different simulated systems when reaching thermodynamic equilibrium

图4 热力学平衡后，各模拟体系中GLP-1蛋白的典型构象Fig. 4 Typical conformation of GLP-1 protein in different simulated systems when reaching thermodynamic equilibrium

综合图1及图3，GLP-1蛋白N端片段倾向于形成线团（coil）或转折（turn）等结构，而多肽片段Asp15-Val33是否形成螺旋则依赖于微环境。相关实验也发现了类似规律，如Thornton等[25]发现十二烷基磷胆碱（DPC）胶束有助于GLP-1形成含有两个螺旋片段的构象，而Chang等[26]发现三氟乙醇水溶液有助于GLP-1形成单个长螺旋构象。

2.3 五肽在GLP-1蛋白周围的分布情况

本研究利用径向分布函数（g（r））探讨了五肽在GLP-1蛋白周围的分布情况（图5（a））。GA-pep在形成致密聚集体的同时，也倾向于紧紧包围在GLP-1蛋白表面，因而在r= 0.5 nm附近呈现最高峰；KE-pep倾向于分散在水溶液中，从而远离GLP-1蛋白表面。图5（b）显示，五肽主要与GLP-1的10-12位残基和C端螺旋发生接触，而很少能接触到GLP-1蛋白的中间序列部分，这也说明五肽聚集体并没有完全把GLP-1蛋白包埋。

图6（a～c）给出了3个混合体系的模拟快照（snapshot），更直观地显示出五肽在GLP-1蛋白周围的分布情况。GA-pep形成了较为致密的聚集体，只对GLP-1蛋白的两个末端形成了局部包覆，混合体系整体呈现左右结构；KE-pep形成的聚集体非常疏松，均匀分布在GLP-1蛋白周围，但是只与两个末端形成原子接触，混合体系整体呈现核壳结构；RE-pep聚集体介乎其间，更接近GA-pep情形，只与GLP-1蛋白两个末端形成原子接触。本研究还对五肽分子单独存在的溶液体系进行了粗粒化模拟。经过500 ns的热力学松弛，3种五肽分子在水溶液中呈现出了不同的聚集状态，如图6（e～f）所示。与混合体系模拟结果，可见3种五肽分子的不同聚集行为与是否引入GLP-1蛋白无关；换言之，五肽分子的内在特性决定了五肽与目标蛋白之间的相互作用模式。

图5 （a）五肽在GLP-1周围的径向分布情况；（b）GLP-1各个残基与多肽的原子接触情况Fig. 5 （a） Radial distribution functions （RDF） of around GLP-1; （b） Atomic contacts with pentapeptides for each residue of GLP-1

图6 各模拟体系中多肽在GLP-1蛋白周围的典型分布Fig. 6 Typical distribution of pentapeptides around GLP-1 protein in different simulated systems

2.4 五肽包埋GLP-1蛋白的驱动力分析

为继续探究五肽形成聚集体及包覆GLP-1蛋白的驱动力，本文统计了混合体系内的静电相互作用情况。由图7可见，KE-pep与GLP-1蛋白形成了最少的静电作用，同时KE-pep聚集体内部也形成最少的静电作用，这充分说明KE-pep具有最高的亲水性，倾向于均匀分散在水溶液中。RE-pep聚集体内部形成了最多的静电作用，但与GLP-1的静电作用稍微低于GLP@GA体系，这体现了驱动力的差异：RE-pep以静电作用作为形成聚集体的主要驱动力，而GA-pep同时利用静电及疏水作用形成致密聚集体，并以此与GLP-1形成最多的原子接触。相比游离GLP-1蛋白，与五肽混合后，其两个末端被迫分开，内部静电作用稍有减少。

为了探究五肽中各残基对驱动力的贡献，本文进一步统计了各残基与GLP-1的原子接触数。如图8所示，GA-pep中Gly3和Ala4与GLP-1形成了最多的接触，而Val1和Pro2与GLP-1形成了最少的接触，这说明疏水性强的Val1和Pro2相互靠拢，驱动GA-pep形成致密聚集体；其C端朝外，与GLP-1蛋白形成接触。相比KE-pep，RE-pep的Val1和Arg3与GLP-1蛋白形成了最多的接触，且明显高于KE-pep对应的残基；这说明，RE-pep的Arg3不但有利于自身形成聚集体，也促进了其与GLP-1蛋白形成局部包覆。

图7 各模拟体系中静电相互作用情况Fig. 7 The electrostatic interactions among GLP-1 protein and pentapeptides in different simulated systems

相较GA-pep，两性离子多肽KE-pep和RE-pep都显示了亲水性。本文统计了水分子在ZIPP关键残基周围的径向分布函数。如图9所示，Glu4侧基氧原子周围的水分子密度基本相似，但Lys3侧基氮原子周围的水分子密度明显高于Arg3。这表明KEpep喜欢分散在水环境中，而富含精氨酸的RE-pep更喜欢与其他残基形成静电作用。

图8 各模拟体系中五肽各残基与GLP-1蛋白的原子接触数Fig. 8 Atomic contacts with GLP-1 for each residue of pentapeptide

2.5 GLP-1蛋白的动力学性质

本研究使用两个序参量刻画GLP-1蛋白的动力学性质。图10显示，各残基在其位置附近的涨落明显受到了五肽的影响。引入五肽后，GLP-1蛋白序列的中间部分形成了螺旋结构，其位置涨落受到抑制；但其N末端相关残基的位置涨落变动更强烈，尤其是GLP@GA体系，这表明GA-pep聚集体与GLP-1蛋白N端的相互作用稍弱。

图9 水分子在两性离子多肽特定残基周围的径向分布：（a）赖氨酸及精氨酸侧基N原子周围的水分子分布；（b）谷氨酸侧基O原子周围的水分子分布Fig. 9 Radial distribution of water molecules around some specific residues of zwitterionic pentapeptides: （a） The distribution of water molecules around N atoms of the side groups of LYS and ARG; （b） The distribution of water molecules around the O atom of the side groups of GLU

图10 各模拟体系中GLP-1蛋白的动力学性质：（a）各残基的根均方（RMSF）涨落情况；（b）GLP-1均方位移（MSD）随时间变化情况Fig. 10 Kinetic properties of GLP-1 protein in different simulated systems: （a） The root-mean-squared fluctuation （RMSF） of each residue；（b） The mean-squared displacement （MSD） of GLP-1 as functions time

水溶液中，GLP-1蛋白与五肽混合后，其扩散能力也必然受到影响。图10计算了不同模拟体系中GLP-1蛋白的均方位移。基于爱因斯坦扩散理论，游离GLP-1的扩散系数为0.13 nm2/ns，与GA-pep、KE-pep或REpep混合后，其扩散系数分别降低至0.036 s、0.047 s、0.014 nm2/ns。可见五肽聚集体明显阻碍了GLP-1在溶液中的扩散，尤其是RE-pep，其聚集体密度低于GA-pep，但最强烈地影响了GLP-1的扩散能力；相比而言，由KE-pep组成的松散外壳对GLP-1的扩散阻力最小。

3 结 论

（1）游离GLP-1的两末端相互靠近，形成环状构象，螺旋比例仅为30%；而与五肽混合后，GLP-1两末端倾向于与五肽形成相互作用，中间片段形成较为规整的螺旋结构。

（2）两性离子五肽VPKEG具有较高的亲水性，倾向于均匀分散在水溶液中，在GLP-1周围形成疏松的保护层。两性离子五肽VPREG以静电作用为主，倾向于相互靠拢形成聚集体，也稳定了GLP-1的长螺旋结构。对照组VPGAG具有较高的疏水性，倾向于形成致密的聚集体，虽然与GLP-1形成了最多的原子接触，但未能充分包埋GLP-1并提供足够的保护。

（3）赖氨酸、谷氨酸组合让两性离子五肽VPKEG具备了恰当的亲疏水性和静电作用，既能维持GLP-1螺旋构象，也避免了被免疫蛋白识别，赋予其“隐身”特性。