蘑菇毒素分析研究进展

◎ 毛新武，刘 璐，陈 婷，易云婷

（广州市食品检验所，广东 广州 510000）

1 蘑菇毒素种类概述

蘑菇安全事关人们的健康与生命，近100年来，各国科学家和菌物工作者对有毒蘑菇开展了大量的研究工作，最早可追溯到19世纪[1]。1891—1893年，德国人Kobert开始研究欧洲的鹅膏菌（A. phalloides）毒素。后来，德国Freiberg大学的Heinrich Wieland提取鹅膏毒素，获得了鹅膏菌毒素的结晶体，并确定了鹅膏菌毒素的元素组成和分子量。

国内对毒蘑菇的系统研究最早开始于20世纪七八十年代，包括毒蘑菇的种类调查、毒性及其中毒类型。据文献[1]介绍，我国已报道的毒蘑菇约500种，主要的剧毒蘑菇有灰花纹鹅膏、致命鹅膏、黄盖鹅膏白色变种、拟灰花纹鹅膏、淡红鹅膏、裂皮鹅膏、黄盖鹅膏、假褐云斑鹅膏近似种、条盖盔孢伞、毒沟褶菌和亚稀褶红菇等。目前已发现的鹅膏毒素有九大类，其中环肽类毒素22种，抗毒环肽酰胺1种，溶血活性蛋白1种。其中能确定结构的是鹅膏毒肽（Amatoxins）、鬼笔毒肽（Phallotoxins）及毒伞素（Virotoxins）等22种环肽类毒素，其典型化学结构式见图1[2]。

2 蘑菇毒素仪器分析技术进展

α-鹅膏毒肽和β-鹅膏毒肽是最主要的致死毒素，因此蘑菇毒素的检测多集中于鹅膏毒肽的检测，国内外都对此进行了大量研究，建立了显色检测法[3-4]、放射免疫检测法[5-7]、酶联免疫[8-9]、紫外吸收光谱法[10]、高效液相色谱[11-12]和液相色谱串联质谱法[13-17]等多种分析方法。质谱技术的发展为蘑菇毒素的检测提供了更为快速、准确的技术支持，适用于蘑菇毒素中毒事件中毒素的确证分析。

图1 鹅膏毒肽、鬼笔毒肽及毒伞素化学结构式图

近年来，由于液相色谱-质谱（LC-MS）联用，特别是串联质谱新技术的不断出现，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）已成为现代分析化学中的重要部分。与高效液相色谱（HPLC）相比，LC-MS/MS所需样本量少，选择性好，特异性强，灵敏度高，可实现生物样品和食品等复杂基质中鹅膏肽类毒素的痕量分析，液相色谱-飞行时间-质谱联用技术（LC-TOF-MS）能对样品中化合物进行质谱全信息采集，更适合分析毒蘑菇中毒患者的体液，可同时检测多种毒素。LC-MS/MS逐渐成为鹅膏肽类毒素分析的主流技术[18]。

以上方法都属于标物依赖性定向分析（Targeted Analysis）技术，仅适用已知的毒素检测，需依赖标准物质进行定性。但是，在目前已知的22种鹅膏毒素中，仅有5种能够获得商业化标准物质，且商业化标准物质非常匮乏，需依赖进口，且购买周期长，导致检测时效性和准确性差，筛查效率低，无法及时应对食物中毒突发事件，远不能满足食品安全应急监管的需要。目前蘑菇中毒事件的定性仍然以形态学鉴定为主，90%以上的蘑菇中毒事件未能进行蘑菇鉴定和毒素检测，给该类食品安全事故应急处置和临床救治造成了较大困扰，目前研究的重点集中在高分辨质谱的筛查方法研究[19]。

3 非标物依赖筛查技术

蘑菇中毒素众多，迄今已有超过100种毒素被鉴定[20]，且不断有新的毒素被发现[21]，如魏佳会[22]等采用高效液相色谱-高分辨质谱联用技术对12种剧毒鹅膏菌的肽类毒素成分及其相对含量进行了比较研究。共检测出19种化合物，其中13种属于已知鹅膏肽类毒素，5种为未知鹅膏肽类毒素，1种为未知小分子化合物组分；ZHOU等[23]从引起云南不明原因猝死的毒沟褶菌（Trogiavenenata）中分离获得了2个新的毒素成分，即2R-氨基-4S-羟基-5-己炔酸（2R-amino-4S-hydroxy-5-hexynoic acid） 和 2R-氨基-5-己炔酸（2R-amino-5-hexynoic acid），其对小鼠的半致死剂量分别为71 mg·kg-1和84 mg·kg-1。张烁[24]利用高分辨质谱离子轨道阱平行反应监测（PRM）与全离子裂解（AIF）相结合的模式，建立了基于特征碎片的毒素筛查方法，在6个剧毒鹅膏样品中发现了11个环肽类毒素，其中4个鉴定为amaninamide、phallisacin、Alal-viroidin和viroidin，其他为新化合物。这是首次在鳞柄鹅膏以外的种属中发现了virotoxin类化合物，且含量很高，这一新发现打破了对virotoxin的传统认知。这些新毒素的出现为蘑菇毒素的检测和中毒早期临床诊断提出了新的挑战。液相色谱串联质谱法属于定向分析，无法检测这些新发现的蘑菇毒素和17种缺少标准物质的已知毒素，存在潜在风险。

非定向筛查分析（Non-Targeted Analysis）是由代谢组学发展而来的一种新型分析方法，运用超高效液相色谱-高分辨质谱技术，采集一级、二级质谱的原始数据，经过峰匹配以及滤噪处理后，利用目标化合物特征离子的精确质量数、同位素匹配、二级碎片信息进行数据库匹配，在无标准品情况下非定向筛查小分子化合物，具有未知物鉴定能力强的优点。本方法已经广泛应用在食品中农兽药残留、非法添加物、植物毒素生物活性物质和新型污染物的筛查检测中，是目前最前沿的分析方法。

但是，高分辨质谱在非定向分析时数据的稳定性、重复性以及定量的线性范围等方面仍存在一定的缺陷。以三重四极杆质谱多反应监测（MRM）或离子轨道阱平行反应监测（PRM）为代表的定向分析技术，具有稳定性好，定量准确的优点。因此，本文拟将非定向分析的高通量、无偏的分析信息获取和定向方法的高特异性检测和准确定量相结合，在非定向筛查方法建立时用高分辨质谱获取代谢物的离子对信息，而在转换为实际样品分析时定向多反应检测（MRM）方式或平行反应监测（PRM）的目标化合物物丰度定性比和质谱参数，从而实现定向/非定向分析方法的整合，建立覆盖度高、线性和重复性良好，且不需要标样来限定检测的蘑菇毒素整体检测方法。

同时，质谱分析易受样品基质干扰，传统的蘑菇毒素样品前处理方法包括固相萃取（SPE）和溶剂提取，前处理时间长，成本较高，而且不可避免会提取到样品中的磷脂和脂肪，造成严重基质效应，不适合非定向分析。QuEChERS是近年来最新发展起来的一种用于农产品检测的快速样品前处理样品的技术，通过提取、净化等步骤，达到快速提取待测组分、同时除去多余的水及其他杂质的目的。

目前该类研究在疾病特征肽的研究中有所发展，其中决策树分类器，给予显著性测试的特征选取，基于模拟退火算法组合优化模型的蛋白质质谱数据特征选取等均有相关的研究报告，考虑参考其对应的数理统计方法与模型进行食品领域数据的拓展与探索。

4 结语

笔者认为，蘑菇毒素检验的发展方向应为：①整合定向/非定向分析策略，立全组分蘑菇毒素分析方法和技术平台，揭示毒素裂解特征反应和特征离子，构建的分子特征峰提取和分子结构智能解析方法，提升未知毒素筛查鉴定效率和准确度。②设计特异性净化毒素的QuEChERS试剂包和非标物依赖定向/非定向筛检方法包，提高检验效率和分析灵敏度，实现快速筛查。③应用多肽组学研究分析与挖掘方法，探索毒蘑菇特征肽信息与其分类情况，为可疑蘑菇鉴定、蘑菇毒素确证和中毒早期临床诊断提供技术支持。