基于网络药理学探究健心胶囊治疗心律失常的作用

浦 强唐海军徐蕾蕾王婧伟王丽晓沈安明

（如皋市中医院，江苏 如皋226500）

心律失常是心脏科高发病和常见病，可单独发病，亦可与其他心血管疾病伴发，是临床上常见而极具危险性的心血管疾病［1］。心律失常常因冠状动脉粥样硬化性心脏病、高血压心肌病、心肌炎、风湿性心脏病、甲状腺功能亢进等器质性心脏病引起，主要发病机制为心脏活动的起源和传导障碍导致心脏搏动的频率或节律异常，临床表现有心悸、心慌、胸闷、疲乏气短，常伴有头晕、出汗、呼吸困难等症状，严重者可出现晕厥，甚至猝死［2⁃3］。临床治疗有药物治疗、射频消融、植入性心律转复除颤器、心脏再同步化及心脏复律除颤器等，主要仍以抗心律失常药物治疗为主，但抗心律失常药物治疗效果不显著，副作用大，有致心律失常作用，容易造成二次伤害，且存在改善症状不理想、耐药及减药后反复发作等问题。因此，越来越多的人寻求中医中药的治疗，对缓解症状、提高生活质量、降低毒副作用，减少疾病反复发作具有重要作用。

中医学认为心律失常按临床表现属于“心悸、怔忡”等范畴。《素问·至真要大论》及《灵枢·本神》就有“心澹澹大动”“心怵惕”惕惕然而惊，心欲动”的记载。这些记载与心律失常的表现基本吻合。中医学认为该病发病虚实夹杂，虚者气血阴阳亏虚，心失濡养；实者痰饮、瘀血、湿热、火邪上扰，心神不宁，正虚邪恋，互累发病。病机关键为阴阳失调，气血失和，心神失养。治疗以益气和血，宁心安神，调理阴阳为主［4⁃5］。

健心胶囊（黄芪、苦参）由江苏省如皋市中医院基于中医经典理论、采用传统工艺研发的院内制剂（苏药制字Z04001612），方中黄芪味甘，微温，补虚，补气要药；苦参味苦，寒，主心腹结气，补中，能安五脏，定志，黄芪、苦参相配，祛邪扶正，具有益气宁心作用，用于治疗良性心律失常（室性早搏、房性早搏等）、病毒性心肌炎、心脏神经官能症等，临床疗效满意［6⁃7］。前期实验研究也表明，健心胶囊能改善氯仿诱发的小鼠室颤，氯化钡和肾上腺素致大鼠的心律失常作用，其作用机理可能是多通道阻滞和β 受体阻断的多重作用，亦可能与影响植物神经及其递质，或者改变膜对Na＋、Ca2＋、K＋等离子的转运，从而影响膜的电生理特性有关［8］。但由于中药化学成分复杂多样，作用机制具有多靶点、多环节等特点。健心胶囊治疗心律失常具体作用机制尚未完全明确。

网络药理学研究方法采用分析药物、基因、蛋白、疾病等数据库与实验室所得数据，融合多学科的技术和内容，从系统、整体的水平构建多层次网络，去分析药物作用机制［9］。利用网络药理学来预测多成分、多途径、多靶点、协同作用的中药复方及配伍作用机制具有显著的优势。本研究利用网络药理学研究方法研究健心胶囊治疗心律失常药效物质及作用靶点，以期为进一步研究健心胶囊提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 健心胶囊主要候选化合物收集和筛选 根据健心胶囊中2 味中药黄芪（Astragali Radix）、苦参（Sophorae Flaves⁃centis Radix）在2015 年版《中国药典》 中的规范名称，使用中药系统药理学 数据库 和分析平台［10］（TCMSP）（http：／ ／lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php）收集健心胶囊的所有生物活性化合物。以口服生物利用度（oral bioavail⁃ability，OB）≥30%、类药性（Drug⁃likeness，DL）≥0.18为限制条件进行筛选［11］，得到健心胶囊的主要候选活性化合物。并结合中国知网、Pubmed 数据库等文献对于未能入选的化学成分，但报道其有生物活性和药理作用的也纳入候选活性化学成分，建立药物⁃化学成分数据集。

1.2 健心胶囊主要候选化合物潜在作用靶点收集 采用TCMSP 数据库检索健心胶囊主要候选化学成分相关的潜在作用靶点，进而使 用UniProKB（https：／ ／www.uniprot.org／），剔除非人源靶点，将查询得到的所有蛋白名称校正为官方名称（Official symbol）。化合物通过检索Puchem 数据库［12］（https：／ ／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）查询结构，生物活性等详细信息。采用网络图像化软件Cytoscape 3.7.2 软件构建“中药⁃化合物⁃作用靶点”网络图，以探究健心胶囊的药理学作用机制。

1.3 心律失常相关疾病靶点收集 采用PharmGkb 数据库［13］、NCBI Gene 数据库［14］、OMIM 数据库［15］、TTD 数据库［16］、Drugbank 数据库［17］、DisGeNET 数据库［18］。在数据库中通过检索关键词“cardiac arrhythmia；arrhythmia”收集与心律失常相关靶点基因，整理后建立心律失常相关靶点数据集。

1.4 “中药⁃化合物⁃作用靶点⁃疾病”网络的构建和分析 将健心胶囊主要候选化合物作用靶点与心律失常靶点数据集进行韦恩（Venn）分析，得到共同的基因集，初步挖掘健心胶囊治疗心律失常的作用靶点。进而构建“中药⁃化合物⁃作用靶点⁃疾病”网络图，节点（node）代表健心胶囊单味中药、化合物与作用疾病靶点，边（edge）用来连接中药与化学成分、化学成分与作用疾病靶点，显示中药⁃化学活性成分⁃心律失常疾病靶蛋白的靶向关系，以探究健心胶囊治疗心律失常的药理学作用机制。

1.5 靶点类 型归属 DisGeNET［18］（http：／ ／www.disgenet.org／，Version 6.0，2019 年1 月更新）数据库是一个包含与人类疾病相关的基因和变体集合的公开数据库，将“1.4”项下潜在靶点输入DisGeNET，得到靶点的类型（Protein Class）。

1.6 蛋白质⁃蛋白质互作网络构建 将“1.4”项下得到的交集靶蛋白基因在线上传String 数据库（https：／ ／string⁃db.org／），限定物种人，得到蛋白互作信息，构建蛋白质⁃蛋白质相互作用关系（Protein⁃Protein Interaction，PPI）网络图，寻找靶点和靶点间作用关系［19］，利用Cytoscape 3.7.2软件中的cytoNCA 插件功能，进行网络拓扑学分析选出核心靶点，其在网络中信息传递效率高，能更多地影响其他节点，在网络中作用显著。分析内容选取度（Degree cen⁃trality，DC）值，介度中心性（Betweenness centrality，BC）值，接近中心性（Closeness centrality，CC）值等［20］。

1.7 富集分析 利用DAVID 工具（https：／ ／david.ncifcrf.gov／，David 6.8），将“1.4”项下共同靶点基因导入功能注释工具，进行Gene Ontology（GO）、KEGG 功能注释富集分析。Gene Ontology 富集分析包括生物过程（Biological Process）、细胞组 成（Cellular Component）、分子功 能（Moleular Function），与KEGG Pathway 富集分析共同寻找活性成分作用靶点显著富集的功能注释与通路，以预测健心胶囊治疗心律失常的可能机制。以P＜0.05 为筛选条件。

2 结果

2.1 健心胶囊候选化学成分信息及筛选结果 本研究通过TCMSP 数据库对健心胶囊中黄芪、苦参所含生物成分进行检索，以OB≥30%和DL≥0.18 为限制条件对健心胶囊活性生物成分进行初步筛选，并结合文献报道，对没有入选但明确有心血管获益的活性的成分，如黄芪甲苷（astraga⁃loside Ⅳ）、黄芪皂苷（astragaloside Ⅰ⁃Ⅲ）、氧化苦参碱（oxymatrine）等［21⁃22］，也纳入后续的研究中，去掉重复化合物，得到活性生物成分结果为黄芪26 种、苦参46 种，见表1。

表1 健心胶囊中68 个候选化合物

续表1

2.2 健心胶囊主要化学成分潜在作用靶点收集结果 检索70 个候选化合物相关的潜在靶点，其中有MOL006571 等27 个化合物在数据库中未找到相关靶点，故予剔除。剩余化合物，共得到232 个作用靶点，其中黄芪214 个，苦参207 个。采用Cytoscape3.7.2 软件构建“中药⁃化学成分⁃作用靶点”网络图（图1），网络图中包括275 个节点（2 个中药节点，41 个化合物节点，232 个作用靶点节点）和813 条边。其中绿色节点代表中药，黄色和粉红色节点代表化合物，蓝色节点代表化合物对应的潜在靶点，每条边则代表化合物分子与靶点之间的作用关系。其中槲皮素（quercetin）、芒柄花黄素（formononetin）为黄芪、苦参共有化合物。一个节点的度值（degree）表示网络中和节点相连路线的数目。分析网路图degree 值前5 位化合物依次为槲皮素quercetin（149），山柰酚kaempferol（63），木犀草素luteolin（57），7⁃O⁃甲基异 丙醇胺7⁃O⁃methylisomu⁃cronulatol（46），芒柄花黄素formononetin（40）。这些数据表明，这些degree 值高的化合物有可能在健心胶囊的药理功能中发挥着较为重要的作用。

图1 中药⁃化学成分⁃作用靶点相互作用网络图

2.3 心律失常相关疾病靶点的收集 采用OMIM 数据库、PharmGkb 数据库、Drugbank 数据库、TTD 数据库、DisGeNET 数据库及NCBI Gene 数据库，通过检索关键词“cardiac arrhythmia；arrhythmia”收集心律失常相关靶点基因，分别收集到56、4、55、19、131、173 个，剔除重复，共收集到274 个心律失常相关疾病靶点。

2.4 健心胶囊潜在作用心律失常靶点信息、靶点类型归属健心胶囊潜在作用靶点和心律失常疾病靶点Venn 分析，得到22 个共同的靶点基因（图2）。并且将交集靶点集导入DAVID 数据库，限定物种人，将所有靶基因名称校正为其官方名称（official gene symbol），得到22 个共同靶点（表2）。其中，黄芪对应21 个靶点，苦参对应19 个靶点，多数靶点2 种药物都同时具有。将这22 个靶点输入Dis⁃GeNET 数据库，得到靶点类型的信息，包括酶（水解酶、氧化还原酶、转移酶、连接酶、激酶、细胞连接蛋白酶等）、转运体、转录因子、受体、核酸受体等（表2），表明健心胶囊通过不同靶点类型发挥药效，且这些作用靶点共同作用、互相调节可能增强了健心胶囊治疗作用。

表2 健心胶囊潜在抗心律失常靶点

图2 健心胶囊潜在作用靶点⁃心律失常疾病靶点Venn 图

2.5 “中药⁃化学成分⁃作用靶点⁃疾病”网络的构建和分析结果 利用Cytoscape 3.7.2 软件构建“中药⁃化学成分⁃作用靶点⁃疾病”网络，分析网络：网络中有61 个节点（其中中药2 个，化学成分节点35 个，靶基因节点23 个，疾病节点1 个）和184 条边（图3），根据网络药理学筛选方法，平均Degree 值为4，筛选所得核心化合物，这些化合物可能是健心胶囊发挥治疗抗心律失常作用的关键（表3）。

图3 中药⁃化学成分⁃作用靶点⁃疾病网络图

表3 健心胶囊治疗心律失常核心化合物拓扑分析

2.6 蛋白质⁃蛋白质互作网络构建及分析 将“2.4”项下得到的22 个基因检索String 数据库，得到蛋白与蛋白之间的互相作用信息，蛋白互作关系，并进一步导入Cytoscape软件，如图4 所示。该网络图中PDE3A 与其他靶点之间无相互作用，故网络图中未显示；包含21 个节点、46 条边，代表了蛋白之间相互作用，网络中degree 值越大，节点越大，而Combine score 值越大，边越粗，各节点的平均自由度为4，筛选得到NOS3（12）、IL6（10）、SLC6A4（8）、GJA1（7）、PRKCA（6）、PTGS2（6）、ADRA1B（5）、MMP3（5），推测这些靶点可能是健心胶囊治疗心律失常的重要靶点，表明健心胶囊治疗心律失常可能通过多个靶点联合共同发挥作用。

图4 潜在核心靶蛋白互作网络图

2.7 GO 注释及KEGG 通路富集分析

2.7.1 靶点生物学功能GO 注释结果 使用DAVID 工具对获得的健心胶囊潜在治疗心律失常的22 个靶标基因进行GO 富集分析，结果提示生物过程中主要富集到血管收缩的积极调节、腺苷酸环化酶激活肾上腺素能受体信号通路、血小板活化、细胞⁃细胞信号传导、积极调节平滑肌收缩、去甲肾上腺素⁃肾上腺素血管收缩参与全身动脉血压的调节、细胞溶质钙离子浓度的正调节、对药物的反应、调节心室肌细胞膜复极化等，细胞组成中富集到细胞质膜、细胞质膜的整体成分，分子功能中富集到α1 肾上腺素能受体活性、支架蛋白结合、酶结合，可见健心胶囊涉及多个生物学过程发挥作用（表4）。

表4 健心胶囊治疗心律失常候选靶点的GO 富集

2.7.2 靶点KEGG 通路富集分析结果 使用DAVID 工具对获得的共同靶标基进行KEGG 富集分析，以P＜0.05 为基准筛选，共获得17 个通路富集，包括环鸟苷酸⁃蛋白激酶G（cGMP⁃PKG）信号通 路、血管内 皮生长因子（VEGF）信号通路、心肌细胞中的肾上腺素能信号传导、唾液分泌、钙离子信号通路、血管平滑肌收缩、神经活性配体⁃受体相互作用、间隙连接、HIF⁃1 信号通路、PI3K⁃Akt 信号通路、雌激素信号通路、阿米巴病、TNF 信号通路、5⁃羟色胺能突触通路、癌症通路、鞘脂信号通路、醛固酮调节的钠重吸收等。并通过Omicshare（http：／ ／www.omicshare.com／tools／Home／Soft／search）对富集分析结果进行可视化处理。其中，Y 轴代表通路名称；X 轴代表富集因子（RichFactor，即目标基因中属于这个通路的基因的数量／背景基因集中这个pathway 所有基因的数量）；气泡面积大小代表目标基因集中属于这个通路的基因数量；气泡颜色代表富集显著性，即P⁃value 数值的大小（图5）。

图5 健心胶囊治疗心律失常候选靶点KEGG 富集分析

3 讨论

中医治疗以整体观念、辨证论治为基本原则，中药化学成分复杂，且复方作用机制和配伍机制较难分析，具有多成分、多靶点、多途径的特点。而网络药理学具有整体性和动态性的特点，为我们提供了研究中药的一种新策略。本研究基于网络药理学手段，通过对健心胶囊进行成分，靶点与疾病的生物信息学综合网络构建，初步探究了该药治疗心律失常的可能作用机制。

健心胶囊由黄芪和苦参组方而成。现代药理研究发现，黄芪具有抗氧化，抗炎，免疫调节，抗肿瘤，降血脂，降血糖和利尿作用［21⁃22］。在心血管系统保护方面，黄芪具有保护心肌、改善心肌缺血、抑制心肌肥厚、抑制心肌纤维化、保护血管内皮细胞、促进血管生成、抑制血管平滑肌细胞增殖、抑制心肌重构及抗心律失常等保护心脏作用［23⁃24］。苦参具有抗病毒、抗炎、消肿利尿、抗肿瘤作用，同时抗心律失常、调节免疫作用，广泛用于心律失常、心力衰竭、病毒性心肌炎、冠心病等作用［25⁃26］。

本研究筛选得到健心胶囊中41 个具有治疗心律失常靶点的化合物，部分成分的有效性已被证实。MOL000098 槲皮素是一种具有多种生物活性的化合物，具有抗氧化、抗炎、降糖，保护心脏等多种作用［27］。槲皮素能降低心肌细胞的自律性、延长不应期、保护心肌细胞膜上的Na＋⁃K＋⁃ATP 酶、拮抗外钙内流等直接抗心律失常作用［28］。山柰酚属于黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、预防心血管疾病等多种药理活性［29］。木犀草素是黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、免疫调节、血管生成及神经保护作用等多种作用［30］。在缺血／再灌注损伤的糖尿病大鼠模型中，木犀草素可保留心脏功能，减少梗死面积和心肌细胞凋亡，降低心律失常的发生率［31］。芒柄花黄素具有抗氧化应激，抗炎作用［32］，并具有调节体内血脂代谢和预防动脉粥样硬化的作用［33］，发挥保护心脏作用。

蛋白相互作用网络图表明健心胶囊治疗心律失常的靶蛋白之间存在着相互关系，是一个复杂交错的网络，并非单独发挥作用。分析网络，筛选得到的NOS3、IL6、SLC6A4、PTGS2、CXCR4、GJA1、PRKCA、ADRA1B、MMP3，这些核心靶点均与心肌细胞代谢、心电活动、血流灌注等显著相关，均被大量的实验研究论证，可能是健心胶囊治疗心律失常的重要作用靶点。

一氧化氮合酶（NOS）是唯一能限制左旋精氨酸生成一氧化氮的合成酶，它的变化直接影响着一氧化氮的生成及发挥的作用。一氧化氮是内皮依赖的血管舒张因子，具有舒张血管、调节血压、抑制血小板聚集与黏附、抑制血管平滑肌细胞增生、防止脂蛋白氧化等生物学作用［34］，在心律失常中作为内源性心脏保护因子［35］。白细胞介素6（IL⁃6）由纤维母细胞、单核／巨噬细胞等产生，作用于血管系统，促进血管内皮细胞表达黏附分子和其他炎症递质，增强局部炎症反应。研究表明，心房颤动患者中炎症介质IL⁃6 水平显著上升，心房收缩受损可促进炎症前的改变，IL⁃6 的水平已被认为是高危房颤患者中风和死亡、异常炎症与血栓栓塞的独立预测因素［36］。缝隙连接蛋白43（CJA1）是相邻细胞间形成缝隙连接，允许离子之间跨细胞互相流动，是动作电位更加协调的基础，可编码Cx43 基因，Cx43 功能缺陷是房颤等心律失常发生的原因之一［37］。α1B⁃肾上腺素受体（ADRA1B）属于G 蛋白偶联受体超家族成员，是去甲肾上腺素的主要靶受体，能够激活多项下游的信号转导起到预防心力衰竭条件下心脏病理性重塑的作用。并能激活细胞内信号转导路径，减少钙离子流，显著延长动作电位时间，导致心律失常［38］。基质金属蛋白酶3（MMP3）是一种在细胞外基质降解及再塑中发挥重要作用的锌离子依赖的中性蛋白酶，其在动脉粥样硬化、及心肌重构过程中发挥着重要作用［39］。这些进一步说明本研究测得的结果的可靠性和科学性。

另外，健心胶囊候选作用心律失常靶基因KEGG 通路的显著富集通路涉及cGMP⁃PKG 信号通路、VEGF 信号通路、心肌细胞中的肾上腺素能信号传导、唾液分泌、钙离子信号通路、血管平滑肌收缩通路。目前研究表明，cGMP⁃PKG 信号通路具有增强心脏收缩力，抑制肥大和影响细胞重塑作用，可通过PDEs 信号通路调节cAMP 信号通路，发挥保护心肌作用［40］。VEGF 由血管内皮细胞分泌，是最关键的血管生成促进因子，在生理性和病理性血管新生过程中发挥着重要作用，可增加微血管与小静脉血管的通透性，促进血管新生，从而改善心肌缺氧，缓解心绞痛［41］。钙离子通道是心脏电活动、机械偶联调控及维持心脏正常节律的中心环节，Ca2＋的失调控是收缩失能和心律失常的主要原因［42］。

通过上述分析，本研究预测健心胶囊治疗心律失常的作用机制，可能是通过调控健心胶囊⁃心律失常交接靶基因的表达，改善心肌细胞代谢、心电活动、血流灌注等，调节下游cGMP⁃PKG 信号、VEGF 信号、心肌细胞中的肾上腺素能信号传导、钙离子信号、血管平滑肌收缩等通路，达到治疗心律失常的目的。

综上所述，本研究借助网络药理学的相关数据库信息，对健心胶囊治疗心律失常作用机制进行了系统分析。结果证实了中药治疗疾病的多成分、多靶点、多通路特点，并为健心胶囊的进一步实验研究和临床应用提供了新思路和指明了新方向，同时也为中医药的研究提供了新方法和新思路。但是，由于机体连续性和整体性的生物学特点，网络药理学分析存在数据库和已有实验数据构成的网络模型局限性，其虽能系统地预测药物化学成分作用的靶点，但无法预测靶点的上调和下调，从而预测功能改变的方向，此外也存在药物代谢动力学方面的问题，如靶点在细胞内时空分布的实际问题等，不能揭示完整的药理作用。因此，分析结果需要开展相应的体内外实验加以验证，以期更加全面地阐释中医药治疗疾病多成分、多靶点、多通路的机制。