不同盐酸青藤碱制剂的毛细管电泳分析方法

吴红根仇 萍彭晓珊彭祖仁李 正李文龙*

（1.天津中医药大学中药制药工程学院，天津300193； 2.省部共建组分中药国家重点实验室，天津300193； 3.湖南正清制药集团股份有限公司，湖南 怀化418000）

盐酸青藤碱是从防己科植物青藤Sinomenium acutum（Thunb.）Rehd.et Wils.或毛青藤Sinomenium acutum（Thn⁃nb.）Rehd.et Wils.var.cinereumRehd.et Wils.的干燥藤茎中提取制备的一种生物碱单体［1］，是青藤碱的盐酸盐形式，具有广泛的药理活性，在抗炎、抗免疫、抗肿瘤等方面具有显著作用［2⁃4］。在治疗过程中，青藤碱多种制剂联用的效果要优于单一制剂，由湖南正清制药集团股份有限公司提出的“正清风痛宁风湿与疼痛‘金三角’ 特色疗法”对风湿类风湿性关节炎等风湿病的疗效确切，该疗法以正清风痛宁注射剂电致孔透皮给药、局部注射，正清风痛宁片剂口服联合用药进行风湿与疼痛的治疗，经国内多家医院使用验证具有良好的治疗效果［5］。国内报道的测定盐酸青藤碱制剂的方法多数为HPLC 法［6⁃12］，但该方法具有分离时间长、流动相的消耗大、易造成污染等缺点，且色谱峰不规则，存在拖尾现象。也有研究人员使用其他方法分析盐酸青藤碱制剂，包括毛细管电泳法［13⁃14］、电化学法［15］、拉曼和近红外分析方法［16］，但是这些分析盐酸青藤碱制剂的方法往往是对单一剂型进行分析，适用范围有限，尚未见采用毛细管电泳技术分析多种盐酸青藤碱制剂的普适性方法报道。毛细管电泳法具有分离效率高、检测速度快、样品量小、操作简便、成本低等优点，在中药分析中有较好的应用前景。本研究建立了测定正清风痛宁片、正清风痛宁缓释片、正清风痛宁注射液3 种制剂中盐酸青藤碱含量的普适性毛细管电泳方法，该方法具有快速高效、绿色环保的特点，实用性较好，可用于不同剂型的盐酸青藤碱制剂的含量测定。

1 材料

P／ACETMMDQ Plus 毛细管电泳仪，配备二极管阵列检测器，32 Karat software 工作站（美国Beckman 公司）；未涂层石英毛细管柱（50.2 cm×50 μm，有效长度40 cm，美国Beckman 公司）；针头式滤膜（0.22 μm，迈博瑞生物膜技术有限公司）；AE240 电子天平（瑞士梅特勒⁃托利多公司）；SB⁃5200DTDN 型号超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；FE 20 PH 计（瑞士Mettler⁃Toledo公司）。

盐酸青藤碱对照品（上海源叶生物科技有限公司）。样品由湖南正清制药集团股份有限公司生产，包括正清风痛宁片（每片含盐酸青藤碱20 mg）、正清风痛宁缓释片（每片含盐酸青藤碱60 mg）和正清风痛宁注射液（2 mL ∶50 mg）。硼酸（天津索罗门生物科技有限公司）；Tris（北京索莱宝科技有限公司）；纯水（屈臣氏商标有限公司）；氢氧化钠（分析纯，凯玛特天津化工科技有限公司）；甲醇（色谱纯，美国Fisher 公司）。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备 精密称取盐酸青藤碱对照品2.50 mg于10 mL 棕色量瓶中，适量纯水超声溶解，冷却，放至室温后定容，配制成质量浓度为0.25 mg／mL 的对照品溶液，在4 ℃下贮存备用，进样前过0.22 μm 微孔滤膜。

2.2 供试品溶液制备

2.2.1 片剂 取正清风痛宁片（批号1809103）20 片，用小刀除去包衣，研磨成粉末，精密称取32.94 mg 于25 mL量瓶中，加入适量纯水超声溶解，冷却，待放至室温后定容，即得质量浓度为1.317 6 mg／mL 的供试品溶液，4 ℃下贮存备用，进样前过0.22 μm 微孔滤膜。

2.2.2 缓释片 取正清风痛宁缓释片（批号1809101）20片，研磨成粉末，精密称取32.99 mg 于25 mL 量瓶中，加入适量纯水超声溶解，冷却，放至室温后定容，即得质量浓度为1.319 6 mg／mL 的供试品溶液，在4 ℃下贮存备用，进样前过0.22 μm 微孔滤膜。

2.2.3 注射剂 精密量取正清风痛宁注射液（批号1806401）1 mL（相当于盐酸青藤碱25 mg），置于25 mL量瓶中，加入适量纯水稀释超声，冷却，放至室温后定容，即得质量浓度为1 mg／mL 的供试品溶液，在4 ℃下贮存备用，进样前过0.22 μm 微孔滤膜。

2.3 电泳条件 采用未涂层石英毛细管色谱柱（50.2 cm×50 μm，有效长 度 40 cm）；缓冲液 H3BO3⁃Tris（0.2 mol／L）；进样方式电动进样；电压10 kV；进样时间5 s；分离电压15 kV；在262 nm 波长下进行检测。新的毛细管柱在首次使用时需做活化处理，分别用甲醇10 min、纯水10 min、1 mol／L NaOH 20 min、纯水20 min，运行缓冲液冲洗15 min。样品运行前依次用NaOH、水、缓冲液各冲洗5 min，所有溶液进毛细管之前均经过0.22 μm 微孔滤膜过滤。电泳色谱图见图1。

图1 不同样品毛细管电泳色谱图

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 精密称取盐酸青藤碱对照品0.5 mg，按“2.1”项下方法制备质量浓度为0.5 mg／mL 的盐酸青藤碱对照品溶液，精密量取适量，置于不同的10 mL棕色量瓶中，加纯水稀释并定容，得到盐酸青藤碱质量浓度分别为15.625、31.25、62.5、125、250、500 mg／mL的溶液，在“2.3”项电泳条件下进行测定，记录盐酸青藤碱的色谱峰面积。以峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X）进行回归，得方程为Y＝6.50×104X＋541.57（r＝0.998 8），在15.625～500 μg／mL 范围内线性关系良好。

2.4.2 精密度试验 取同一质量浓度的盐酸青藤碱对照品溶液，在“2.3”项条件下连续进样6 次。结果显示，盐酸青藤碱峰面积和迁移时间的RSD 分别为1.82%、0.45%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 精密称取片剂粉末，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项条件下于0、2、4、6、8、10、12、24 h 进样，测得盐酸青藤碱的峰面积和迁移时间的RSD 分别为1.34%、1.25%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.4 重复性试验 精密称取片剂粉末，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项条件下连续进样6 次，测得盐酸青藤碱峰面积、迁移时间RSD 分别为1.80%、0.86%，表明该方法重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验 精密称取片剂粉末32.9 mg，平行6 份，分别加入盐酸青藤碱质量相当于0.491 mg 的对照品溶液，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项条件下进样，计算回收率，结果见表1。

表1 盐酸青藤碱加样回收率试验（n＝6）

2.4.6 检测限 将样品逐级稀释，在“2.3”项条件下计算峰面积响应值与基线噪音的强度，以S／N ＝3 为检测限，测得结果为0.613 8 μg／mL。

2.5 样品含量测定 取盐酸青藤碱制剂3 种剂型各3 批，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.3”项条件下进样，计算含量和迁移时间，结果见表2。

表2 3 种盐酸青藤碱制剂含量测定结果（n＝9）

3 讨论与结论

缓冲液在毛细管电泳分析中起着决定性作用，本实验尝试了磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、硼砂⁃氢氧化钠缓冲液、硼酸⁃氢氧化钠缓冲液、硼酸⁃硼砂缓冲液、Tris⁃盐酸缓冲液、硼酸⁃Tris 缓冲液。通过比较发现只有硼酸能够将杂质峰与样品峰分开，而且Tris 能够有效的改善拖尾。在选定了缓冲液种类之后，对缓冲液的pH 进行优化，分别在pH 6.24、6.43、6.5、6.6、6.83 下进行试验，发现只有在pH 6.5 的时候分离效果最佳，在这个环境下杂质峰和样品峰能够完全基线分离，并且基线噪音干扰最小，且峰形最美观。电压的大小影响出峰速度，电压较大时出峰速度快，但易造成基线不稳，也可能使峰的分离效果不好，电压较小时，能实现峰的分离，但易造成拖尾，本实验在电压分别为10、15、20 kV 的条件下进行试验，发现在电压为15 kV 时，峰的分离效果最好。

通过建立毛细管电泳方法，在4 min 内将盐酸青藤碱制剂中的物质完全分离，这种方法与现有的分离盐酸青藤碱的方法相比，明显缩短了分析时间，并且大大减少了有毒试剂的消耗。因此，该方法简便环保，稳定可靠，具有一定实用性，可快速鉴定盐酸青藤碱，以期为其制剂质量的进一步研究提供参考。