基于UHPLC⁃Q⁃TOF⁃MS／MS 技术快速分析杜仲抗补体活性部位的入血成分

郭 飒贾 佳温 泉何明珍*姚 闽冯育林杨世林

（1.江西中医药大学，江西 南昌330006； 2.江西省药品检验检测研究院，江西 南昌330006）

补体在免疫系统中发挥着重要作用，其激活主要通过经典和旁路两条途径。补体过度激活会导致人体正常的组织产生损伤，在许多疾病的发病过程中扮演着重要角色，如急性肺损伤、类风湿性关节炎等［1］。目前，对于补体的抑制已成为治疗诸多疾病的首要关注点。据报道，中药材中的诸多成分，如黄酮、多糖、甾体等［2］均具有较好的抗补体活性。

杜仲Eucommia ulmoidesOliv.，为杜仲科植物，为名贵的中药材，主要分布于陕西、甘肃、河南、湖北、江西、安徽等省区［3］。现代研究表明，杜仲的主要成分包括黄酮、苯丙素、木脂素等，经研究发现其具有降血压、降血糖、保肝、抗炎等活性［4］。同时，现代研究表明，抗炎活性与抗补体活性息息相关［5］，然而杜仲的抗补体活性研究却鲜见报道。本实验首先对杜仲石油醚、乙酸乙酯、正丁醇及水部位进行补体抑制活性检测，结果显示乙酸乙酯与正丁醇部位均具有较好的抗补体活性；其次，在前期实验中课题组对乙酸乙酯部位和正丁醇部位的成分进行了研究，发现2 个部位有相交的部分，只是含量不同，因此，基于UHPLC⁃Q⁃TOF⁃MS／MS 技术，对相交部分含量较高的正丁醇部位的入血成分进行研究，并快速鉴别了体内12 种原型入血成分，以期为杜仲的进一步利用开发奠定基础。

1 材料

SpectraMax i3 多功能酶标仪（美国Molecular Devices 公司）；Triple TOFTM5600＋高分辨质谱仪（美国Sciex 公司）；Analyst TF 1.6 和peakview 1.2 数据处理系统（美国Sciex公司）；LC⁃30A 超高液相色谱仪（日本岛津公司），配置LC⁃30AD 高压输液泵、CBM⁃20A 系统控制器、SIL⁃30AC 自动进样器（美国Molecular Devices 公司）；Sartorious BT25S型分析天平（十万分之一，德国赛多利斯公司）；N⁃1001D⁃OSB2100 旋转蒸发仪（南京泰诺施格科学仪器有限公司）；KQ250DB 型数控超声清洗器（巩义市予华仪器有限公司）。

京尼平苷（批号J⁃028⁃161216）、京尼平（批号10080⁃201409）、异绿原酸C（批号PRF8060542）对照品均购自成都瑞芬思生物科技有限公司。水（广东屈臣氏食品饮料有限公司）；巴比妥缓冲液（pH 7.4，北京雷根生物技术有限公司）；肝素钠和绵羊血（北京索莱宝科技有限公司）；溶血素（上海延慕有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国Fisher 公司）；甲酸（色谱纯，美国Sigma 公司）；其余试剂为分析纯。

杜仲采自江西吉水县，经江西省药品检验检测研究院高级工程师姚闽鉴定为杜仲科杜仲属植物杜仲Eucommia ulmoidesOliv.的干燥树皮。

2 方法

2.1 药材提取 取杜仲药材500 g，粉碎后用80%乙醇加热回流提取2 次，每次1 h，分别依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取，减压回收溶剂后，即得相应部位萃取物，减压干燥，备用。

2.2 补体经典途径CH50测定

2.2.1 供试品溶液制备 称取杜仲石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水4 个部位萃取物适量。依次用30 μL DMSO、770 μL BBS 溶液超声溶解。用BBS 溶液对倍稀释成8 个浓度的供试品溶液（1 ∶2、1 ∶4、1 ∶8、1 ∶16、1 ∶32、1 ∶64、1 ∶128、1 ∶256）。

2.2.2 补体的效价测定 参考文献［6］，取一定的豚鼠血清（补体），制备成1 ∶2 的溶液，并对倍稀释成1 ∶4、1 ∶8、1 ∶16、1 ∶32、1 ∶64、1 ∶128、1 ∶256 溶液。取1 ∶3 000溶血素100 μL、上述各浓度补体200 μL 和2%SRBC 溶液100 μL，溶于200 μL BBS 溶液中，混匀，置于37 ℃水浴温育30 min，离心后取上清在405 nm 处测定吸光度（A）。以三蒸水溶血管的吸光度作为全溶血标准，选择达到相似吸光度的最低补体浓度作为正常溶血所需要的临界补体浓度。

2.2.3 药物经典途径抗补体活性测定 吸取“2.2.2”项下确定的临界补体浓度与供试品溶液，分别加入100 μL 溶血素和2% SRBC 溶液，于37 ℃水浴反应30 min，离心，取上清液，405 nm 处测定吸光度（A）。

2.3 液相条件 参考文献［7］，Welch Ultimate XB⁃C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相0.1% 甲酸（A）⁃乙腈（B），梯度洗脱（0.01～4 min，5% B；4～10 min，5%～10% B；10～25 min，10%～13% B；25～37 min，13%～27% B；37～45 min，2%～90% B；45～49 min，90%B；49～50 min，90%～5%B；50～56 min，5%B）；柱温40 ℃；体积流量0.3 mL／min；进样量2 μL。

2.4 质谱条件 在负离子模式下采用电喷雾电离源（ESI）；喷雾电压（ISVF）－4 500 V；雾化器（GS1）和辅助器（GS2）均为50 psi（1 psi＝6.895 kPa）；质量扫描范围为m／z50～1 250；数据采集时间为56 min；采用母离子触发的子离子（TOF⁃MS⁃IDA⁃MS／MS）扫描方式；碰撞能量（CE）－35 eV；碰撞能量叠加（CES）15 eV。

2.5 生物样品采集 取SD 大鼠7 只，随机分为杜仲给药组（5 只）和正常组（2 只），杜仲给药组给药剂量为12 g／kg，空白组按12 g／kg 剂量给予生理盐水。分别于给药后0.5、1、2、4、6 h 对各组大鼠进行眼眶静脉丛取血约300 μL，离心，取上清，保存于－40 ℃冰箱中备用。

2.6 生物样品处理 取0.5、1、2、4、6 h 待测血浆各30 μL 混合于4 mL 离心管中，加入50 μL 甲酸，再加入5倍量甲醇沉淀蛋白，涡旋，离心，取上清液，氮气吹干，50%甲醇100 μL 复溶，涡旋，离心，取2 μL 上清液进行UHPLC⁃Q⁃TOF⁃MS／MS 分析。

3 结果

3.1 经典途径补体效价测定 将补体用BBS 溶液对倍稀释成8 个浓度后加到溶血体系中，用于评价其效价，见图1。当稀释度为1 ∶2～1 ∶32 时，溶血率为100%，显示达到全溶血状态；当补体稀释度为1 ∶64 时，全溶血率为（68.49±6.1）%，未引起全溶血，表明个体之间有一定的差异性。因此，稀释度为1 ∶32 的豚鼠血清作为经典途径抗补体实验中所使用的补体浓度。

图1 经典途径不同稀释度豚鼠血清的效价（%，，n＝3）

3.2 抗补体活性部位确定 以肝素钠为阳性对照药［CH50为（0.028±0.006）mg／mL］，分别对杜仲石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水4 个部位萃取物进行经典途径抗补体抑制活性测试，得到乙酸乙酯和正丁醇部位萃取物经典途径抗补体活性CH50值分别为0.072、0.049 mg／mL，石油醚和水部位萃取物无活性。结果见图2。

图2 杜仲各部位抗补体活性

3.3 入血成分 采用UHPLC⁃Q⁃TOF⁃MS／MS 技术对大鼠血浆进行入血成分分析，通过与对照品进行对比，综合对照品的保留时间及质谱信息，对本实验所得图谱进行筛查和鉴定。在大鼠空白血浆中未出现而在大鼠给药血浆和杜仲正丁醇部位萃取物中相对应位置共同存在的色谱峰，即为杜仲正丁醇部位萃取物原型吸收入血成分，通过此方法共鉴定出12 种原型入血成分。见图3、表1。

表1 杜仲正丁醇部位萃取物原型入血成分鉴定

图3 各样品总离子流图

3.4 入血成分解析 化合物1 为柠檬酸，一级质谱保留时间在1.32 min 时，出现m／z为173.008 9 的峰，推测为［M⁃H2O］－的峰，以其作为母离子进行全扫描，产生2 个主要的碎片离子，碎片m／z129.019 1 为母离子失去一个CO2分子的［M⁃CO2］－峰，碎片m／z111.009 4 为母离子失去一个H2O 分子和CO2分子的［M⁃CO2⁃H2O］－峰，经对照品对照，鉴定为柠檬酸，其分子式C6H8O7，为有机酸类。

化合物2 为4⁃glucopyranosyloxy⁃3⁃benzoic acid，一级质谱保留时间为3.32，PeakView 中XIC Manager 软件推测其分子式C14H18O9，该化合物二级质谱中，产生碎片离子m／z167.034 4、152.010 8、123.044 5、108.021 5 母离子丢失162 Da 后得到167.034 4 碎片离子，可能含有香草醛结构。因此，推测该化合物为4⁃glucopyranosyloxy⁃3⁃benzoic acid。

化合物3 为京尼平苷，一级质谱保留时间在3.69 min时，出现m／z为211.061 2 的峰，推测为［M⁃Glu］－的峰，以其作为母离子进行全扫描，产生了2 个主要的碎片离子，分别为碎片m／z193.050 4 为母离子失去一个水分子［M⁃H2O］－峰和碎片m／z167.071 5 为母离子失去一个甲基分子的［M⁃CO2］－峰，经对照品对照，鉴定为京尼平苷，分子式C16H22O10，为环烯醚萜类。

化合物4 为京尼平，一级质谱保留时间在15.33 min时，出现m／z为207.066 1 的峰，推测为［M⁃H2O］－的峰，以其作为母离子进行全扫描，产生2 个主要的碎片离子，碎片m／z177.054 7 为母离子失去一个甲氧基分子的［M⁃CH3O］－峰，经对照品对照，鉴定为京尼平，分子式C11H14O5，为环烯醚萜苷类。

化合物5 为异绿原酸C，一级质谱保留时间在33.14 min时，出现m／z为353.088 0 的峰，推测为 ［M⁃Glu］－的峰，以其作为母离子进行全扫描，产生了1 个主要的碎片离子，即为碎片m／z353.088 0 为母离子失去一个葡萄糖分子的［M⁃Glu］－峰，经对照品对照，鉴定为异绿原酸C，分子式C25H24O12，为苯丙素类。

4 讨论

杜仲是我国传承千年的名贵药材，其用途广泛，被称为“植物黄金”［8］。本实验通过抗补体经典途径研究了杜仲石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水4 个部位萃取物的抗补体活性，结果表明，杜仲石油醚和水部位萃取物无明显抗补体活性，而正丁醇部位萃取物的抗补体活性最好，为杜仲的最佳抗补体活性部位。

UHPLC⁃Q⁃TOF⁃MS／MS 具有分 析快速、分辨率 高、灵敏度好、重复性好等特点，是天然产物鉴定复杂成分的有力手段［9⁃10］。本实验采用此分析技术对杜仲入血成分进行研究，共鉴定出12 种原型入血成分。根据入血成分可能是中药的有效活性成分［11］这一观点，结合参考文献［12⁃13］ 分析推测其可能为潜在的抗补体活性成分。

本实验从抗补体活性与入血成分两方面对杜仲进行研究，以期有助于拓宽对杜仲药用功效的认知，同时也为进一步讨论杜仲的药效活性提供参考。