化痰活血方通过IL⁃13 信号通路对哮喘小鼠肺组织MUC5AC 分泌的影响

魏义杰毛晓健傅榕冰伍林泽胡旭红童晓云黄 丰*

（1.腾冲市中医医院，云南 腾冲679100； 2.云南中医药大学，云南 昆明650500； 3.云南中医药大学第一附属医院，云南 昆明650021）

支气管哮喘是以气道炎症为代表的多种病理因素参与的慢性呼吸道疾病，最新报道显示，我国患者已有4 750万［1］，因此，相关工作的推进日益紧迫。正常人体也会分泌黏液，黏液作为固有免疫系统的第一道屏障，具有保护和湿润气道的作用，然而在某些病理状态下，气道粘液分泌异常是哮喘病死率居高不下的重要原因［2⁃3］。因此，药物有效的干预其生成有积极地临床意义。

化痰活血方由三子养亲汤加桃红四物汤组成，本课题组前期研究显示，该方可抑制哮喘小鼠肺泡灌洗液中多种炎性因子的生成，并且能明显抑制与黏蛋白MUC5AC 生成密切相关的IL⁃13 的生成［4⁃6］。因此，本实验拟观察化痰活血方调节哮喘小鼠肺组织IL⁃13／MUC5AC 通路中各分子的变化，探讨其可能作用的分子机制。

1 材料

1.1 动物 Balb／c 雌性小鼠，6 周龄，购自长生生物技术股份有限公司，生产许可证号［SCXK（辽）2015⁃0001］。

1.2 仪器 超声雾化仪（德国百瑞有限公司）；酶标仪［美谷分子仪器（上海）有限公司］；RT⁃qPCR 仪（美国罗氏公司）；离心机（德国海蒂斯公司）。

1.3 试剂 OVA（美国Sigma 公司，批号A5253，Grade II）；Al（OH）3（上海阿拉丁生化科技有限公司，批号38701）；地塞米松（美国Sigma 公司，批号D1756）；抗MUC5AC 抗体（武汉伊莱瑞特生物科技有限公司，批号E⁃AB⁃40037）；抗IL⁃13 抗体（批号bs⁃0560R）、抗IL⁃4Rα 抗体（批号bs⁃23579R）、抗GAB2 抗体（批号bs⁃2885R）、抗Phospho⁃GAB2 抗体（批号bs⁃3177R）、抗FOXA2 抗体（批号bs⁃2358R）（北京博奥森生物技术有限公司）；抗Phospho⁃IL⁃4Rα 抗体（批号PA5⁃38614）、抗Phospho⁃IL⁃13Rα1 抗体（批号PA5⁃38607）（美国Thermo Fisher 公司）；抗IL⁃13Rα1抗体（英国Abcam 公司，批号ab79277）；RNA 抽提液（武汉塞维尔生物技术有限公司，批号G3013）；cDNA 合成试剂盒（美国Thermo 公司，批号K1622）；荧光定量试剂盒（瑞士Roche 公司，批号04913914001）。

2 方法

2.1 分组、造模 小鼠随机分为正常组、模型组、地塞米松组及化痰活血方高、中、低剂量组，造模及各给药组小鼠腹腔注射3 次OVA 以致敏 ［第1、8、15 天，OVA 1 mg／mL，Al（OH）35 mg／mL］，0.2 mL／只；正常组予同体积生理盐水注射。3 周后，连续1 周（30 min／次）2%OVA 雾化，正常组小鼠给予同体积生理盐水处理。

2.2 给药 于第21 天开始灌胃给药，连续7 d。正常组、模型组均给予生理盐水（0.1 mL／10 g），阳性药物组给予地塞米松（1 mg／kg），化痰活血方高、中、低剂量组分别给予相应剂量化痰活血方（30、15、7.5 g／kg）。

2.3 取材 于实验第28 天处死小鼠，取右中肺，石蜡包埋备用。

2.4 免疫组化法检测相关蛋白的表达 取小鼠肺组织，分别加入“1.3”项下IL⁃13／MUC5AC 通路中各抗体，用图像软件进行比对，统计平均光密度值（IOD／Area）。

2.5 肺组织MUC5AC 基因定量分析 提取各小鼠肺组织Total RNA，进行荧光定量PCR检测。引物分别为5′⁃GGACTTCAATATCCAGCTACGC⁃3′（正向）、5′⁃GGACT⁃TCAATATCCAGCTACGC⁃3′（反向），对照基因为GAPDH。

3 结果

3.1 对肺组织中MUC5AC 表达的影响 化痰活血方高、中、低剂量组均可抑制小鼠肺组织中MUC5AC 的表达（P＜0.01），见图1。

图1 化痰活血方对MUC5AC 表达的影响（IHC×400）

3.2 对肺组织中IL⁃13 表达的影响 化痰活血方高、中、低剂量组均可降低小鼠肺组织中IL⁃13 的表达（P＜0.05，P＜0.01），见图2。

图2 化痰活血方对IL⁃13 表达的影响（IHC×400）

3.3 对小鼠肺组织中IL⁃4Rα 表达的影响 化痰活血方高、中、低剂量组均可降低小鼠肺组织中IL⁃4Rα 的表达（P＜0.05，P＜0.01），见图3。

图3 化痰活血方对IL⁃4Rα 表达的影响（IHC×400）

3.4 对小鼠肺组织中P⁃IL⁃4Rα 表达的影响 化痰活血方高、中、低剂量组均可抑制小鼠肺组织中P⁃IL⁃4Rα 的表达（P＜0.01），见图4。

图4 化痰活血方对P⁃IL⁃4Rα 表达的影响（IHC×400）

3.5 对小鼠肺组织中IL⁃13Rα1 表达的影响 化痰活血方高、中、低剂量组均可抑制小鼠肺组织中IL⁃13Rα1 的表达（P＜0.01），见图5。

图5 化痰活血方对IL⁃13Rα1 表达的影响（IHC×400）

3.6 对小鼠肺组织中p⁃IL⁃13Rα1 表达的影响 化痰活血方高、中、低剂量组可降低小鼠肺组织中p⁃IL⁃13Rα1 的表达（P＜0.05，P＜0.01），见图6。

图6 化痰活血方对p⁃IL⁃13Rα1 表达的影响（IHC×400）

3.7 对小鼠肺组织中GAB2 表达的影响 化痰活血高、中、低剂量组均可抑制小鼠肺组织中GAB2 的表达（P＜0.01），见图7。

图7 化痰活血方对GAB2 表达的影响（IHC×400）

3.8 对小鼠肺组织中p⁃GAB2 表达的影响 化痰活血方高、中、低剂量组均可抑制小鼠肺组织中p⁃GAB2 的表达（P＜0.01），见图8。

图8 化痰活血方对p⁃GAB2 表达的影响（IHC×400）

3.9 对小鼠肺组织中FOXA2 表达的影响 化痰活血方高、中、低剂量组均可升高小鼠肺组织中MUC5AC 抑制子FOXA2 蛋白的表达（P＜0.01），见图9。

图9 化痰活血方对FOXA2 表达的影响（IHC×400）

3.10 各组小鼠肺组织MUC5AC基因的变化 化痰活血方高、中、低剂量组均可抑制小鼠肺组织中MUC5AC基因的表达（P＜0.01），见图10。

图10 化痰活血方对MUC5AC 基因表达的影响

4 讨论

哮喘属于中医哮证范畴，《丹溪纂要·喘》 一书中提及“痰者凡喘，便有痰声”，同时，临床大量患者往往“久病入络”。此外，痰瘀皆为津血化生，痰瘀常相互为患［4，7⁃8］。在此理论指导下，前期研究了化痰活血方防干预哮喘的多种机制，其可明显抑制与黏蛋白生成密切相关的IL⁃13 上下游分子，为进一步阐释其作用机制，本实验从IL⁃13／MUC5AC通路入手，观察化痰活血方对其中各个环节的作用。

MUC5AC 的异常分泌是哮喘患者临床导致气道阻塞的重要成分，并与哮喘气道炎症相关［9］。比如，IL⁃13 异常产生可导致气道杯状细胞化生（黏蛋白主要分泌细胞）［10］。Haj 等［11］人采用免疫组化检测哮喘患者肺组织中MUC5AC和IL⁃13 的表达，发现其表达较高。从图1～2 中可知，经化痰活血方干预后，MUC5AC 和IL⁃13 表达明显下降，说明化痰活血方能明显抑制哮喘状态下MUC5AC 的生成，其作用途径可能与IL⁃13 通路相关，因此，本实验对通路上的各蛋白进行了检测。

IL⁃13R 是由IL⁃4Rα 和IL⁃13Rα1 链共同组成的异源二聚体［12⁃13］，本实验中采用免疫组化对哮喘小鼠肺组织中IL⁃13 受体IL⁃4Rα 和IL⁃13Rα1 表达水平进行检测，实验结果表明化痰活血方能够显著降低IL⁃4Rα 和IL⁃13Rα1 在哮喘小鼠肺组织中的表达，说明化痰活血方可以抑制二者的表达，可能存在抑制性成分抑制其受体（图3、图5）。同时，检测了p⁃IL⁃4Rα 和p⁃IL⁃13Rα1（图4、图6），结果显示，化痰活血方能明显降低p⁃IL⁃4Rα 和p⁃IL⁃13Rα1 的表达。IL⁃13R 是气道上皮细胞膜表面受体，在各种因子的刺激下，可激活并上调MUC5AC［14］。化痰活血方能抑制IL⁃13R的各蛋白磷酸及非磷酸化蛋白的表达，说明化痰活血方对杯状细胞该通路的上游分子可能有抑制作用，继而抑制MUC5AC 的分泌。

近年相关研究显示，GAB2 的表达与MUC5AC 的分泌呈现正相关关系［15］。在炎症因子的刺激下，IL⁃4Rα 与IL⁃13Rα1 可活化并形成异二聚体，接着活化络氨酸蛋白激酶TYK2，进一步导致STAT6 磷酸化，然后下调MUC5AC 基因负反馈因子FOXA2 基因，从而上调MUC5AC 的基因表达［16⁃18］。哮喘气道黏液分泌过程调节中，FOXA2 直接作用于气道上皮细胞抑制MUC5AC 基因的转录，是多条调节黏液分泌信号通路的汇合点［19⁃20］。免疫组化法对哮喘小鼠GAB2、P⁃GAB2、FOXA2 蛋白检测发现，化痰活血方能显著降低哮喘小鼠肺组织中GAB2、p⁃GAB2 的表达（图7～8），升高FOXA2 水平（图9）。采用荧光定量PCR 结果显示，化痰活血方能从基因水平抑制MUC5AC的表达（图10）。

综上所述，化痰活血方高剂量对IL⁃13 信号通路各蛋白及黏蛋白MUC5AC 的调控作用较强，中剂量次之，低剂量较次之，存在一定的浓度依赖性。化痰活血方可通过调节IL⁃13 信号通路来下调黏蛋白MUC5AC基因表达，继而减少哮喘小鼠的黏液分泌情况，从而达到改善哮喘肺部病理情况。但化痰活血方针对IL⁃13 信号通路干预MUC5AC生成的机制研究需进一步深入研究，比如要借助基因干扰技术进一步明确其作用的特异靶点。