蛹虫草固态发酵对玉米粉加工性质及消化性的影响

杨 爽 ，肖 瑜

（1.吉林工程技术师范学院食品工程学院分子营养重点实验室，吉林长春 130052；2.吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林长春 130118）

玉米是我国第三大粮食作物，也是我国重要的农产品，2019年我国玉米总产量已达2.608亿吨[1]。相关统计表明，全球1/3人口以玉米为主食[2]。而我国玉米的消费形式，大部分以饲料用粮和工业原料为主。玉米主食的加工也仍然停留在粗浅阶段，大部分传统的玉米主食产品无法满足人们对营养、卫生和安全的需要，导致经济效益水平偏低[3]。玉米风味独特，但食用品质差，具有加工性能低的缺点，如玉米主食产品普遍存在产品硬度大、易老化、口感粗糙[4]等问题。玉米主食产品中的原料玉米粉淀粉含量约70%，淀粉的消化性与人体的许多疾病密切相关。淀粉的消化性受多种因素影响，包括淀粉的来源、直链/支链淀粉比例、支链淀粉的精细结构等，而玉米淀粉大部分是由支链淀粉组成，易被人体消化吸收[5]。这些都在一定程度上制约了玉米主食工业化的发展。

近年来，关于谷物性质改良研究越来越多[6−7]，微生物发酵技术是其中的一种安全性和适用性较好的改良技术。蛹虫草（Cordyceps militaris（L） Link），又名为北虫草、北冬虫夏草，是食品研究中被广泛应用的食药用真菌，人们在功能活性成分制备、产品研发等方面做了大量的工作[8−9]。近几年，越来越多研究者利用虫草发酵改善农产品功能特性与营养特性，包括以鹰嘴豆[10]、红豆[11]和燕麦[12]等为底物利用蛹虫草固态发酵，提高底物活性成分含量及功能活性研究。当前研究中，关于蛹虫草固态发酵对玉米粉加工特性和消化性的影响研究还未见报道。因此，本研究利用蛹虫草固态发酵，旨在改良玉米粉的性质，从而为蛹虫草固态发酵技术改良谷物性质的处理方法提供参考，同时为玉米主食制品的开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蛹虫草菌株 由吉林农业大学小麦和玉米国家工程实验室提供；总淀粉试剂盒、直链淀粉/支链淀粉试剂盒K-TSTA 爱尔兰Megazyme；D-葡萄糖检测试剂盒K-GLUC 爱尔兰Megazyme；猪胰α-淀粉酶（A3176） 8×USP/mg，美国Sigma-Aldrich公司；淀粉葡萄糖苷酶（A7095） 260 U/mL，美国Sigma-Aldrich公司。

全自动氨基酸分析仪 日本日立公司；快速粘度测定仪 澳大利亚Perten公司；物性仪 英国Stable Micro Systems公司。

1.2 实验方法

1.2.1 固态发酵 参考前期实验室蛹虫草固态发酵玉米粉的发酵条件优化试验结果，利用蛹虫草固态发酵玉米粉，具体步骤如下：将活化后的蛹虫草斜面菌种切成1 cm×1 cm菌块接种到液体种子培养基中，24 ℃，160 r/min摇床震荡培养3 d，将液体种子破碎后接种到灭菌后玉米粉中，接种量为10%（干重），置于24 ℃下培养5 d后灭活终止反应，在不同发酵时间取3瓶样品，于60 ℃下烘干至恒重，灭菌后玉米粉作为对照。将烘干后的发酵产物过80目备用。

1.2.2 理化成分的测定

1.2.2.1 总淀粉和直链淀粉含量的测定 采用总淀粉试剂盒和直链淀粉/支链淀粉试剂盒测定发酵前后总淀粉和直链淀粉含量。

1.2.2.2 粗脂肪含量的测定 参考GB/T 5009.6-2003食品中脂肪的测定[13]。

1.2.2.3 可溶性蛋白含量的测定 采用福林-酚方法[14]。称取1.5 g样品加入6 mL水，45 ℃提取2 h，超声30 min，4000×g 离心10 min，取上清13000×g离心10 min，取上清过0.22 μm滤膜，取0.2 mL滤液加定容至1 mL，空白1 mL水，500 nm酶标仪OD值。标准曲线的绘制采用牛血清蛋白稀释液，根据牛血清蛋白稀释液浓度和OD值绘制标准曲线。得到的标准曲线的线性回归方程为：y=0.47945x+0.00177，R2=0.9951。

1.2.2.4 氨基酸的测定 Li等[15]方法。准确称取发酵过程中粉末0.1 g，加10 mL 6 mol/L的HCl，再加100 μL的β-巯基乙醇，置于液氮中冷冻，冷冻后利用氮气进行封管约80 S以上，再将水解管放在110 ℃烘箱中水解22 h。水解结束后取3 mL样品进行浓缩，取2 mL pH 2.2的三氯乙酸加入浓缩后样品中，在4 ℃条件下保持2 h，过0.22 nm有机膜，利用全自动氨基酸分析仪测定17种常见氨基酸含量，氨基酸含量为g/100 g。

1.2.3 水溶指数（water-solubility index, WSI）和吸水指数（water-absorption index, WAI）测定 参考Siroha等[16]的方法，取发酵前后的样品，粉碎过80目筛，2.5 g，置于已知重量离心管中，加入30 mL蒸馏水，搅拌30 min，4000×g 离心10 min，将上清液倒入铝盒，烘干至恒重称重，同时称量离心沉淀的重量。WSI和WAI计算如下：

1.2.4 糊化特性的测定 利用快速粘度测定仪（Rapid Visio Analyser, RVA）进行测定：称4.0 g 样品置于盛有25 mL蒸馏水的铝盒中，装入RVA上，按下塔帽进行测试。在160 r/min下搅拌混合，样品在50 ℃下保持l min；然后再以12 ℃/min的速度升温至 95 ℃；保持95 ℃条件下2.5 min，以12 ℃/min的速度降至50 ℃；在50 ℃保持1.4 min，得到样品的糊化曲线。记录样品的峰值粘度、谷值粘度、衰减值、回生值、峰值时间。

1.2.5 质构特性的测定 参考于长筹[17]的方法。将糊化后的样品，4 ℃下贮藏24 h制备凝胶，取样利用物性仪测定凝胶的质构特性。具体参数为：测试前速度：2.00 mm/s；测试中速度：2.00 mm/s；测试后速度：1.00 mm/s；形变量：20%；两次下压间隔时间：5 s；负载力：5 g。探头类型：P2.5。

1.2.6 体外消化性的测定 淀粉体外消化率参考Englyst等[18]方法测定：800 mg样品置于15 mL乙酸钠缓冲溶液（0.1 mol/L，pH 5.2）。37 ℃下平衡10 min，加5 mL混合酶溶液（淀粉酶和淀粉葡糖苷酶），于37 ℃恒温水浴摇床酶解。在20、120 min分别取出0.5 mL，并与4 mL无水乙醇混合灭酶，4500×g离心10 min。使用K-GLUC试剂盒测上清中葡萄糖含量。快消化淀粉（RDS），慢消化淀粉（SDS）和抗性淀粉（RS）的含量根据以下公式计算：

式中，G0：上清液中样品的游离葡萄糖含量，G20：20 min时释放的葡萄糖含量，G120：120 min时释放的葡萄糖含量，W是样品的重量，TS是总淀粉含量。

1.3 统计学分析

每个试验至少做三次平行试验，结果表示为平均值±标准差。试验数据采用SPSS 22.0软件进行方差分析与相关性分析，用OriginPro 8.5软件做分析图表。

2 结果与分析

2.1 发酵对玉米粉理化成分组成的影响

发酵对玉米粉理化组成的影响结果如表1所示，固态发酵对玉米粉理化成分产生明显影响，其中发酵初期（0～2 d），发生略微变化，而随着发酵时间的延长，即发酵的第3 d，理化成分出现显著变化（P<0.05）。其中，总淀粉含量随发酵时间延长呈显著下降的趋势（P<0.05），说明蛹虫草固态发酵对玉米淀粉具有较好的水解力。到第3 d，总淀粉降低了11.7%。与此同时，直链淀粉含量明显增加，到第3 d增加了29.8%。刘红艳等[19]研究表明，食用菌在发酵过程中能够产生α-淀粉酶、纤维素酶和β-葡萄糖苷酶，将大分子物质分解成小分子物质。蛹虫草发酵过程中产生的α-淀粉酶水解淀粉，主要发生在支链淀粉的长链部分，使其分解为直链淀粉或者葡萄糖等小分子，使得支链淀粉含量降低，直链淀粉含量增加。这和猴头菌固态发酵玉米粉结果中直链淀粉含量增加，支链淀粉含量降低结果一致[20]。玉米中的蛋白质主要是水溶性较差的醇溶蛋白，而可溶性蛋白含量较少，不易被生物体所利用。由表1所示，发酵0～2 d，可溶性蛋白增加缓慢，3 d后可溶性蛋白含量明显增加。虽然在发酵0～2 d，可溶性蛋白含量变化不显著（P>0.05），但由表2可看出固态发酵显著增加了必需氨基酸和总氨基酸含量（P<0.05），即发酵初期即可改善玉米蛋白氨基酸的组成，到发酵的第3 d，必需氨基酸和总氨基酸含量分别增加了26%和28.7%，其中苏氨酸、缬氨酸和蛋氨酸分别增加了39.1%、42.8%和81.8%。Angulobejarano等[21]利用米曲霉固态发酵鹰嘴豆粉，对其蛋白中氨基酸组成进行测定，结果发现固态发酵可提高含硫氨基酸（蛋氨酸、半胱氨酸）、苏氨酸和缬氨酸等必需氨基酸含量。根据相关报道[22]，蛹虫草酶系发达，能够分泌大量的淀粉酶、纤维酶、蛋白酶、肽酶等，可以将淀粉和蛋白质水解成低聚糖、葡萄糖、多肽、肽和氨基酸等。表2结果表明玉米蛋白被分解成了氨基酸、多肽和一些有一定空间结构但分子质量较小的蛋白质，增加了蛋白质的溶解性，使得可溶性蛋白含量增加。

表1 发酵对玉米粉理化成分组成影响Table 1 Effect of fermentation time on physicochemical composition of corn flour

2.2 发酵对玉米粉水溶指数（WSI）和吸水指数（WAI）的影响

水溶指数和吸水指数是玉米粉加工过程中重要的应用性质，WSI 和 WAI 分别反映了粉体的降解和糊化程度，其中 WAI 越大，产品会产生黏牙感，会对产品品质造成一定影响[23]，因此对发酵前后玉米粉的WSI和WAI进行测定。如图1所示，固态发酵显著提高WSI（P<0.05），在发酵第5 d，WSI增加了274.4%；与此同时，WAI随发酵时间的延长呈下降的趋势，到第5 d，降低40.4%，这和黑曲霉固态发酵高粱粉，WAI呈增加的结果不同[24]。这可能是由于所选择的微生物菌种不同，具有不同的生长特性和产生不同的发酵产物。虽然在固态发酵过程中，利用微生物酶解作用来改良谷物粉的品质特性，但不同于其他微生物，蛹虫草固态发酵酶解玉米粉的同时，其产生的菌丝体覆盖在了玉米粉表面，可能导致其不利于淀粉与水发生水合作用。此外，有研究[25]认为在淀粉体系中，添加蔗糖等可溶性成分可与体系中自由水发生相互作用，抑制淀粉的吸水作用。蛹虫草发酵过程中产生的可溶性成分，如多糖、可溶性蛋白等，与淀粉竞争吸水，不利于淀粉与水相互作用，使得WAI降低。

表2 发酵对玉米粉氨基酸组成影响Table 2 Effect of fermentation time on amino acids of corn flour

图1 发酵对玉米粉水溶指数和吸水指数的影响Fig.1 Effect of fermentation time on WSI and WAI of corn flour

2.3 发酵对玉米粉糊化特性影响

发酵对玉米粉糊化性质影响结果如表3所示。由表3可看出，随着发酵的进行，淀粉被不断水解，整体上，发酵后玉米粉糊化峰值粘度、谷值粘度、衰减值和回生值随之降低，到发酵第3 d，其分别降低了47.3%、43.7%、85.4%和34.9%。在0～2 d，糊化黏度参数的上升，可能是由于在发酵初期虽然总淀粉含量变化不显著（P>0.05），但微生物的酶解破坏了淀粉颗粒，有研究认为丝状真菌发酵可破坏淀粉颗粒表面，使其表面出现孔洞[26]，从而有利于糊化过程中水分的扩散，有利于吸水膨胀，从而使黏度增加。发酵第5 d，峰值粘度和谷值粘度又出现上升的现象，但仍低于未发酵样品。这表明固态发酵后玉米粉的糊化黏性参数，仍是主要受淀粉浓度和结构决定的，但与此同时，微生物发酵过程中发生的一系列复杂反应，菌丝体产生的多糖、可溶性蛋白等成分，也对黏度参数产生一定影响，使得发酵后玉米粉黏度增加。

2.4 发酵对玉米粉凝胶质构特性影响

由图2中可知，在发酵的0～2 d，玉米粉凝胶的硬度、弹性、黏合度和咀嚼性略微下降；而随着发酵时间增加，淀粉被不断水解，玉米粉凝胶的硬度和咀嚼性显著下降（P<0.05），到发酵的第3 d，凝胶硬度和咀嚼性分别降低了45.4%和34.8%。玉米粉主食制品在贮藏过程中，常存在老化、咀嚼性差等问题，这也是限值玉米主食制品发展的主要原因之一，由图2的结果可看出，发酵降低凝胶的硬度和咀嚼性，表明发酵可抑制玉米淀粉老化，提高产品适口性。玉米粉凝胶硬度的降低可能与总淀粉含量下降（表1）有关，固态发酵玉米粉中淀粉水解是凝胶硬度降低的主要原因。发酵到第5 d时，淀粉进一步被降解，凝胶硬度下降过多，凝胶呈软塌状态，失去玉米粉凝胶结构，不利于凝胶制品结构的稳定性。以上结果表明，利用蛹虫草固态发酵对玉米粉淀粉进行适度的水解，可降低凝胶硬度，抑制玉米制品的老化，但过度水解淀粉，会丧失玉米淀粉的凝胶结构，有不利的影响。

表3 发酵对玉米粉糊化特性影响Table 3 Effect of fermentation time on pasting properties of corn flour

2.5 发酵对淀粉消化性影响

淀粉消化性是影响淀粉类食品营养功能发挥的重要因素，因此对发酵前后淀粉消化性进行测定。从图3可以看出，固态发酵可以改变玉米淀粉中RDS、SDS和RS的含量，显著影响其消化特性。在发酵0～2 d，固态发酵可使玉米淀粉中RDS含量下降，而SDS含量增加；在发酵的3～5 d，固态发酵使SDS和RS均显著增加（P<0.05），在发酵的第3 d，SDS和RS分别提高至原来的1.83和1.41倍。有研究认为[27]，淀粉的消化性与淀粉颗粒大小、直链淀粉含量以及支链淀粉分支结构等有关。图3结果表明，SDS和RS随直链淀粉含量的增加而增加。Miao等[28]分析认为α-淀粉酶水解玉米淀粉后，可生成具有分支结构的低聚糖，这些低聚物不易被人体消化，使得RS增加。这与本研究结果中RS含量增加相似。RS不能被消化，有利于肠道健康。这表明利用蛹虫草固态发酵玉米粉，可提高SDS和RS含量。随着发酵的进行，淀粉继续被水解，在发酵4～5 d，随着可溶性蛋白、SDS和RS含量进一步增加，可进一步改善玉米粉营养性质。但当发酵至第5 d时，总淀粉含量降低程度较大，使得凝胶硬度下降过多，凝胶呈软塌状态，不利于玉米主食制品结构的稳定性。因此，需要控制微生物对淀粉的水解，使其达到即可抗老化，提高食用品质，又能保有玉米淀粉凝胶结构性质。综合考虑下，控制发酵至第3 d，对玉米粉品质性质具有最适的改良效果。

图3 发酵对玉米粉淀粉消化率影响Fig.3 Effect of fermentation time on digestive properties of corn flour

3 结论

蛹虫草可显著降解玉米淀粉，提高直链淀粉含量，慢消化淀粉和抗性淀粉也随之增加，发酵玉米粉具有更高的抗消化性；经固态发酵后，玉米粉的水溶指数增加而吸水指数降低；固态发酵可显著降低玉米粉糊化的回生值和凝胶硬度（P<0.05），发酵玉米粉具有较好的抗老化性。综合考虑下，发酵至第3 d的玉米粉，具有最佳的改良效果。本研究结果为蛹虫草在玉米主食制品品质改良方面提供一定参考。后续对蛹虫草降解玉米淀粉，对淀粉结晶区和非结晶区结构的影响进行分析，进一步从淀粉分子结构角度解释对淀粉的水解机制。