miR-146a对高糖诱导人视网膜微血管内皮细胞凋亡的抑制作用及其机制

高飞 武志鹏 阮一华

1安阳市人民医院眼科 455001；2郑州大学第一附属医院眼科 450052

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病严重的并发症，是糖尿病患者视力损害和盲的主要原因[1]。DR的发病机制是一个多因素相互作用的过程，其中糖尿病患者血液成分改变所引起的视网膜血管内皮细胞过度凋亡起着一定的作用[2]。目前研究已发现DR与高葡萄糖水平诱导的视网膜微血管损伤有关[3]。视网膜血管内皮细胞能够维持血-视网膜屏障的稳定性，在保护视网膜结构的完整性和良好的视觉功能方面发挥着重要作用。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类具有调节功能的非编码RNA，其可通过调控靶基因或信号通路参与生物发育、细胞增生和凋亡等生理过程[4-5]。miR-146a已被证实参与糖尿病肾病、糖尿病眼病、糖尿病性心脏病等多种糖尿病并发症的发生[6-7]。且已有研究显示，DR患者血清中miR-146a的表达明显降低，提示miR-146a可能参与DR的发生和发展[8]，但其具体作用机制尚未完全明确。本研究探讨miR-146a对高糖诱导视网膜血管内皮细胞凋亡的调控作用及其分子机制，以期为DR的发病机制以及治疗方法研究提供线索。

1 材料与方法

1.1 材料

人视网膜微血管内皮细胞(human retinal microvascular endothelial cells，HRMECs)及其专用细胞培养基(endothelial cell medium，ECM)(美国Sciencell公司)；胎牛血清、D-葡萄糖、Trizol试剂、逆转录试剂盒(美国Gibco公司)；Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司)；miR-146a mimics及对应阴性对照mimics control(上海吉玛制药技术有限公司)；SYBR premix Ex Taq试剂盒(大连宝生物工程有限公司)；噻唑蓝(thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT)(美国Sigma公司)；Annexin Ⅴ-FITC细胞凋亡检测试剂盒(日本Takara公司)；细胞裂解液RIPA、BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天技术研究所)；PVDF膜、超敏ECL化学发光检测试剂盒(美国Millipore公司)；兔抗人Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 related X protein，Bax)单抗(AM009)、兔抗人B细胞淋巴因子2(B-cell lymphoma factor-2，Bcl-2)单抗(AM010)、兔抗人β肌动蛋白(β-actin)单抗(AK348)、兔抗人核转录因子(nuclear factor，NF)-κB p65单抗(AN365)、兔抗人p-NF-κB p65单抗(AN371)及辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(A0516)(美国CST公司)。UV752N型紫外分光光度计(济南童鑫生物科技有限公司)；Mic-4型PCR仪(上海之江生物科技股份有限公司)；E-Gel Imager型凝胶成像仪、Attune NxT型流式细胞仪(美国Thermo Fisher公司)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 将HRMECs接种到含体积分数5%胎牛血清、100 U/ml(商品单位)青霉素和100 μg/ml链霉素的ECM培养基中，放置于体积分数5% CO2、37 ℃细胞培养箱中，每隔1天更换1次新鲜培养液。待细胞生长融合达90%时进行传代培养，取处于对数生长期的HRMECs用于实验。

1.2.2细胞转染miR-146a及实验分组 将HRMECs接种到24孔板中培养，待细胞融合达50%～60%时，参照Lipofectamine 2000脂质体转染试剂说明书，以无血清培养液洗涤细胞2遍，加入250 μl无血清培养液，将细胞分为高糖+miR-146a拟似物组和高糖+拟似物对照组，分别将Lipofectamine 2000(8 μl)与miR-146a mimics或mimics control(4 μl)混合加入培养板中，置于细胞培养箱继续培养6 h后更换含血清的培养液。转染后24 h均在培养基中添加25 mmol/L D-葡萄糖继续培养。同时取正常细胞分为高糖组和正常对照组，于高糖组培养基中添加25 mmol/L D-葡萄糖，正常对照组细胞培养基中D-葡萄糖浓度为5.5 mmol/L。各组细胞继续培养48 h后分别收集细胞，采用实时荧光定量PCR检测miR-146a的转染效率。

1.2.3实时荧光定量PCR检测细胞中miR-146a表达 取各组培养48 h的HRMECs，用Trizol试剂提取细胞中总RNA，紫外分光光度计检测RNA的浓度和纯度。参照逆转录试剂盒说明书合成cDNA。miR-146a正向引物：5’-CGGATCCTTGGTCTCCTCCAGAT GTTTTAT-3’；反向引物：5’-CCTCGAGTCATTAAAG TGATTTTCTCCCAAG-3’。U6正向引物：5’-CTCGCT TCGGCAGCACATA-3’；反向引物：5’-GTGCAGGGT CCGAGGT-3’。以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR扩增。反应体系：SYBR premix Ex Taq 12.5 μl、上游引物0.5 μl、下游引物0.5 μl、荧光探针溶液1.0 μl、cDNA模板2.0 μl、ddH2O 8.5 μl，共25.0 μl。反应程序：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s、60 ℃退火及延伸30 s，共40个循环。各组设置3个复孔，实验重复3次。以U6作为内参，采用2-ΔΔCt法计算各组细胞中miR-146a相对表达量。

1.2.4MTT法检测细胞增生活力 将HRMECs以5×103/孔接种到96孔板中，过夜培养，按照1.2.2的方法分组处理，处理后48 h向细胞中加入10 μl MTT溶液，于37 ℃培养箱中继续培养4 h，弃去上清液，再向每孔细胞中加入100 μl二甲基亚砜，室温下振荡10 min，用酶标仪测定各孔细胞在波长450 nm处吸光度(A)值。每组设置3个复孔，实验重复3次。计算细胞相对活力，细胞活力(%)=实验组A值/对照组A值×100%。

1.2.5流式细胞术检测细胞凋亡率 胰蛋白酶消化各组细胞，磷酸盐缓冲液洗涤细胞2次，离心半径6 cm，12 000 r/min离心5 min收集细胞，加入适量结合缓冲液重悬细胞，制成1×106个/ml的细胞悬液，取100 μl细胞悬液，依次加入Annexin Ⅴ-FITC和PI染液各5 μl轻轻混匀，于室温下避光反应15 min，流式细胞仪上样检测。每组设置3个复孔，实验重复3次。计算各组HRMECs的凋亡率。

1.2.6Western blot法检测细胞中相关蛋白表达 胰蛋白酶消化收集各组高糖培养48 h的HRMECs，加入300 μl RIPA细胞裂解液，低温下提取细胞中总蛋白，采用BCA蛋白浓度检测试剂盒测定蛋白浓度。取等量蛋白样品上样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，将分离蛋白转膜至PVDF膜。将PVDF膜放置在质量分数10%脱脂奶粉中室温封闭1 h，分别加入一抗Bax(1∶ 500)、Bcl-2(1∶ 800)、β-actin(1∶ 500)、NF-κB p65(1∶ 500)、p-NF-κB p65(1∶ 500)，4 ℃孵育过夜；PBST洗膜后，加入相应二抗(1∶ 3 000)，室温下孵育2 h；PBST洗膜后，加入超敏ECL化学发光液显色，采用凝胶成像系统采集图像，采用ImageJ软件分析条带灰度值。每组设置3个复孔，实验重复3次。以β-actin为内参照，计算各组细胞中目的蛋白相对表达量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件进行统计分析，计量资料经Kolmogorov-Smirnov检验证实呈正态分布，均以mean±SD表示，组间均数经方差齐性检验证实方差齐。采用均衡分组单因素干预多水平研究设计，正常对照组、高糖组、高糖+拟似物对照组和高糖+miR-146a拟似物组间各检测指标总体差异比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组HRMECs中miR-146a相对表达量比较

正常对照组、高糖组、高糖+拟似物对照组和高糖+miR-146a拟似物组间细胞中miR-146a相对表达量总体比较，差异有统计学意义(F=112.778，P<0.001)。与高糖组和高糖+拟似物对照组比较，高糖+miR-146a拟似物组HRMECs中miR-146a相对表达量明显升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)；与正常对照组比较，高糖组HRMECs中miR-146a相对表达量明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)(表1)。

2.2 各组HRMECs活性比较

正常对照组、高糖组、高糖+拟似物对照组和高糖+miR-146a拟似物组间细胞活力总体比较差异有统计学意义(F=11.465，P=0.003)。与正常对照组比较，高糖组细胞活力明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与高糖组和高糖+拟似物对照组比较，高糖+miR-146a拟似物组HRMECs活力明显升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)(表1)。

2.3 各组细胞凋亡率比较

流式细胞术检测结果显示，正常对照组、高糖组、高糖+拟似物对照组和高糖+miR-146a拟似物组间细胞凋亡率总体比较差异有统计学意义(F=58.106，P<0.001)。与正常对照组比较，高糖组HRMECs凋亡率显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与高糖组和高糖+拟似物对照组比较，高糖+miR-146a拟似物组HRMECs凋亡率明显下降，差异均有统计学意义(均P<0.05)(表1，图1)。

表1 各组细胞中miR-146a相对表达量、细胞活力及凋亡率比较(mean±SD)

图1 各组HRMECs流式细胞图 高糖组细胞凋亡率高于正常对照组，高糖+miR-146a拟似物组细胞凋亡率低于高糖组和高糖+拟似物对照组 miR-146a：微小RNA-146a

2.4 各组细胞中凋亡相关蛋白、NF-κB p65蛋白表达及其磷酸化水平比较

Western blot法检测结果显示，正常对照组、高糖组、高糖+拟似物对照组和高糖+miR-146a组细胞中Bax、Bcl-2和p-NF-κB p65蛋白相对表达量总体比较差异均有统计学意义(F=42.902、39.810、72.694，均P<0.01)。与正常对照组比较，高糖组HRMECs中Bax和p-NF-κB p65蛋白相对表达量明显升高，Bcl-2蛋白相对表达量明显降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)；与高糖组和高糖+拟似物对照组比较，高糖+miR-146a拟似物组HRMECs中Bax和p-NF-κB p65蛋白相对表达量明显降低，Bcl-2蛋白相对表达量明显升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)。各组HRMECs中NF-κB p65蛋白相对表达量总体比较，差异无统计学意义(F=0.106，P=0.955)(图2，表2)。

图2 各组HRMECs中Bax、Bcl-2、NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白表达电泳图 与正常对照组比较，高糖组HRMECs中Bax和p-NF-κB p65蛋白条带明显增强，Bcl-2蛋白条带明显减弱；与高糖组和高糖+拟似物对照组比较，高糖+miR-146a拟似物组HRMECs中Bax和p-NF-κB p65蛋白条带明显减弱，Bcl-2蛋白条带明显增强，各组NF-κB p65蛋白条带无明显变化 1：正常对照组；2：高糖组；3：高糖+拟似物对照组；4：高糖+miR-146a拟似物组 Bax：Bcl-2相关X蛋白；Bcl-2：B细胞淋巴瘤因子-2；NF-κB：核转录因子-κB；β-actin：β-肌动蛋白

3 讨论

DR的病理机制复杂，了解其发病机制有助于DR新型治疗策略的研发。越来越多的研究表明，miRNA在DR发病中发挥重要作用，可能成为新的治疗靶点[9-11]。Lee等[12]研究显示，2型糖尿病患者的肾小球中miR-146a表达水平降低，且其表达水平与白蛋白尿和肾小球损伤程度相关，表明miR-146a在预防糖尿病性肾小球病和足细胞损伤方面具有新的作用。Chen等[13]研究发现，miR-146a可调节葡萄糖诱导的糖尿病视网膜和肾脏中炎性细胞因子细胞外基质蛋白上调，提示miR-146a可能在DR和糖尿病肾病中发挥重要作用。Lu等[14]研究发现，持续高血糖可引发HRMECs凋亡，从而促进DR的进展。然而，miR-146a对HRMECs凋亡途径的调节机制尚不清楚。本研究探索高糖条件下miR-146a高表达对细胞活力和凋亡、凋亡相关蛋白以及NF-κB p65蛋白磷酸化的影响。本实验参考以往文献[15-16]，采用浓度为25 mmol/L D-葡萄糖干预HRMECs，以建立DR体外细胞模型。本研究结果显示，高糖处理后HRMECs中miR-146a的表达显著下调，细胞活力下降，细胞凋亡增加，而通过转染HRMECs高表达miR-146a可部分逆转高糖所致的细胞活力降低和细胞凋亡。Kim等[17]研究结果显示，高糖环境下培养HRMECs细胞中凋亡关键调节因子Bcl-2表达下调，与本研究结果一致。且本研究结果显示miR-146a过表达可部分恢复高糖诱导HRMECs中Bax的表达升高及Bcl-2的表达降低，推测miR-146a可抑制HRMECs凋亡。

已有研究显示，在人单核细胞、脂多糖诱导的肾小管上皮细胞及人脐静脉血管内皮细胞中，miR-146a与NF-κB之间存在相互调节作用[18-20]。本研究结果显示，HRMECs中miR-146a过表达抑制高糖诱导的NF-κB信号传导通路的激活，提示miR-146a可负向调节高糖环境下HRMECs中NF-κB的活性。NF-κB和Bcl-2家族成员在细胞凋亡反应的调节中存在密切关系，故推测miR-146a可能通过NF-κB途径调节Bcl-2和Bax的表达，从而抑制HRMECs凋亡。本实验尚存在一些不足，如未检测Bax、Bcl-2、NF-TNRB p65和p-NF-TNRB p65基因的表达，且未检测其他信号通路变化，后续实验将对此进行补充和验证。此外，本实验只涉及体外细胞实验在体实验，后续将进行在体研究进一步验证。

综上所述，本研究结果表明高糖可抑制HRMECs中miR-146a的表达，降低细胞活力并诱导细胞凋亡，而过表达miR-146a可部分逆转高糖诱导的此现象，该过程可能与抑制NF-κB信号通路的激活有关。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明高飞、阮一华参与本研究选题，实验过程及论文撰写；武志鹏参与选题，实验指导及论文修改和定稿。