发酵型石榴果醋澄清剂的筛选及工艺条件优化

韩希凤

(天津天狮学院，天津 301700)

果醋作为一种酸性饮料或调味品，由水果及其下脚料经酒精发酵和醋酸发酵制得，因果实中营养物质种类繁多，而具有美白护肤、抗疲劳、生津止渴等多种保健功能[1-2]。随着现代生物发酵技术的发展，传统的食醋在保健作用、口感和风味等方面已不足以满足市场需求，果醋因兼具营养和保健功能而受到消费者的青睐，我国水果资源多、分布广，为果醋的开发提供了有利条件[3]。石榴(pomegranate)不仅含有人体所需的多种氨基酸和微量元素，还含有大量维生素、蛋白质、碳水化合物等营养物质[4]，成为近年来科研工作者研究与开发的对象，石榴果醋是其中的一种产品类型。但经发酵制得的石榴果醋由于果胶等大分子物质的存在，在加工、贮运过程中常常产生沉淀而造成浑浊，对果醋的感官品质和保质期产生不利影响[5]。同时，果醋澄清度是表明其品质高低的重要指标之一，由此，果醋澄清在加工过程中显得尤为重要。

本文以发酵型石榴果醋为研究对象，在前期研究的基础上，利用单因素试验对壳聚糖、明胶、皂土3种澄清剂对发酵型石榴果醋的澄清效果进行对比研究，得出适合发酵型石榴果醋澄清的澄清剂，并通过正交试验优化适宜澄清剂的澄清工艺条件，以期为石榴的开发和利用提供一定的技术支持和理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

陕西酸石榴：选择表皮无损伤、色泽明亮的新鲜石榴。

明胶(食品级)、壳聚糖(食品级)：浙江一诺生物科技有限公司；皂土(食品级)：烟台帝伯士自酿机有限公司，脱乙酰度85%。化学试剂均为分析纯。

TCP2全自动测色色差计 北京奥依克光电仪器有限公司；UV2550紫外可见分光光度计 日本岛津公司；2100Q 便携式浊度仪 上海精密仪器仪表有限公司；WAY-2S型数字阿贝折光仪 上海仪电物理光学仪器有限公司；施都凯MJ-78A型立式全自动高压蒸汽灭菌锅 上海恰森仪器有限公司。

1.2 澄清方法处理

1.2.1 发酵型石榴果醋的制备工艺流程[6]

新鲜石榴→筛选→清洗→榨汁→成分调整(含糖量为16%，pH为4)→灭菌(沸水浴15 min)→冷却→酵母菌活化(2%蔗糖水，28 ℃，15 min)→酵母菌接种→酒精发酵→醋酸菌接种→醋酸发酵→粗滤→澄清→杀菌→成品。

1.2.2 澄清剂的配制

参照吴凯仪等[7]的方法配制。

1.2.3 发酵型石榴果醋澄清剂筛选试验

取粗滤后的发酵型石榴果醋25.00 mL，按照表1分别加入壳聚糖、明胶、皂土3种不同的澄清剂，混匀后，在20 ℃下静置24 h，以4000 r/min离心15 min，取上清液，于720 nm处测定其吸光度值，用公式转换成发酵型石榴果醋的澄清度(T)。

表1 3种澄清剂澄清试验设计

1.2.4 发酵型石榴果醋澄清条件的优化

在单因素试验的基础上，以发酵型石榴果醋澄清度(T)为指标，以壳聚糖用量、处理时间、温度和pH设计四因素三水平L9(43)正交试验，优化壳聚糖的澄清工艺条件，因素水平表见表2。

表2 正交试验因素水平表

1.3 理化指标的检测方法

1.3.1 澄清度(T)的测定

取澄清处理后的石榴果醋15 mL，以4000 r/min离心15 min，取上清液待测，用分光光度计测定A720处的吸光度值，然后用公式转换成透光率T=10-A720 [8-9]。

1.3.2 色度的测定

取澄清处理后的石榴果醋15 mL，以4000 r/min离心15 min，取上清液待测，用分光光度计分别测定A420和A520处的吸光度值，然后用公式转换成色度值A=A420+A520[10]。

1.3.3 发酵型石榴果醋浊度的测定

取澄清处理后的石榴果醋15 mL，以4000 r/min离心15 min，取上清液10 mL，利用浊度仪进行测定。

1.3.4 发酵型石榴果醋色差的测定

取澄清处理后的石榴果醋5 mL，以4000 r/min离心15 min，取上清液待测，参照周禹含等[11]的方法进行测定。

1.3.5 发酵型石榴果醋可溶性固形物的测定

取澄清处理后的石榴果醋5 mL，以4000 r/min离心15 min，取上清液，利用WAY-2S数字阿贝折光仪重复测定3次，取平均值。

2 结果分析

2.1 发酵型石榴果醋澄清剂的筛选

2.1.1 明胶对发酵型石榴果醋澄清效果的影响

明胶分散在水溶液中时会形成带正电荷的体系，可与发酵型石榴果醋中带负电的单宁、多酚、果胶等物质通过静电相互作用，聚集、絮凝而形成沉淀，使果醋得以澄清[12]。

由图1可知，随着明胶用量的增加，发酵型石榴果醋的澄清度(T)呈先增后降的趋势，在明胶用量为0.6 g/L时澄清效果最佳，澄清度(T)由0.74提高至0.85，说明一定量的明胶可提高发酵型石榴果醋的澄清度(T)，但过量的明胶会导致澄清效果下降，可能是由于过量的明胶在果醋中形成絮状体或胶体悬浮液，重新导致了醋体浑浊[13]。因此，选择浓度为0.6 g/L的明胶为发酵型石榴果醋的最佳用量。

图1 明胶用量对发酵型石榴果醋的澄清效果

2.1.2 壳聚糖对发酵型石榴果醋澄清效果的影响

由图2可知，随着壳聚糖用量的增加，发酵型石榴果醋的澄清度(T)先增后降，这与程浩等[14]的研究结果一致。壳聚糖用量为0.3 g/L时，果醋的澄清度(T)高达0.97，澄清效果最好，说明适量的壳聚糖可有效提高发酵型石榴果醋的澄清度(T)。但壳聚糖用量过高则澄清效果不佳，可能与壳聚糖作为一种增稠剂，在果醋中溶解可形成相对稳定的絮凝体系有关，即当壳聚糖吸附能力达到平衡后，过量的壳聚糖反而造成了醋体浑浊。因此，0.3 g/L的壳聚糖用量较为合适。

图2 壳聚糖用量对发酵型石榴果醋的澄清效果

2.1.3 皂土对发酵型石榴果醋澄清效果的影响

皂土由硅酸盐薄片组成，吸收水溶胀后，形成的胶体悬浮液带负电，致使果醋中带正电荷的蛋白质和单宁等物质通过电荷中和作用絮凝沉淀，使果醋澄清[15]。由图3可知，随着皂土用量的增加，发酵型石榴果醋的澄清度(T)先增后降，皂土用量为0.4 g/L时果醋的澄清度(T)由0.88提高至0.96，说明皂土用量适当时，可使果醋中部分浑浊物和带颜色物质发生絮凝沉淀，但过量的皂土由于形成了交替悬浊液，而不利于发酵型石榴果醋的澄清。因此，0.4 g/L的皂土为适宜用量。

图3 皂土用量对发酵型石榴果醋的澄清效果

2.1.4 不同澄清剂对发酵型石榴果醋澄清效果的比较

由表3可知，壳聚糖和皂土对发酵型石榴果醋的澄清效果接近，都达到0.95以上，明胶的澄清效果较差，且发酵型石榴果醋澄清后的色度、色差、浊度均比未澄清的低。进一步分析发现，使用壳聚糖澄清的果醋中的总酸、可溶性固形物均高于用皂土澄清的，因此，壳聚糖是适合发酵型石榴果醋澄清的澄清剂。

表3 发酵型石榴果醋澄清前后的比较分析

2.2 发酵型石榴果醋澄清条件的优化

2.2.1 壳聚糖用量对澄清效果的影响

由图4可知，在一定的处理温度、时间和pH值条件下，壳聚糖用量在0.1～0.5 g/L范围内时，随着壳聚糖用量的增加，发酵型石榴果醋的澄清度(T)先升后降，当壳聚糖的用量为0.3 g/L时，澄清效果最好，果醋的澄清度(T)达到最大值0.97，随后随着壳聚糖用量的增加，果醋的澄清度(T)开始下降，故壳聚糖用量为0.3 g/L较适宜。

图4 壳聚糖用量对发酵型石榴果醋的影响

2.2.2 处理温度对壳聚糖澄清发酵型石榴果醋效果的影响

由图5可知，在一定的壳聚糖添加量、处理时间和pH值条件下，处理温度在20～45 ℃范围内时，随着处理温度的升高，发酵型石榴果醋的澄清度(T)先升后降，当处理温度为30 ℃时，果醋的澄清度(T)达到最大值0.97，随着处理温度的升高，果醋的澄清度(T)开始下降，故选取处理温度30 ℃较适宜。

图5 处理温度对壳聚糖澄清发酵型石榴果醋的影响

2.2.3 处理时间对壳聚糖澄清发酵型石榴果醋效果的影响

由图6可知，在一定的壳聚糖添加量、温度和pH值条件下，处理时间在1.0～3.5 h范围内时，随着处理时间的增加，发酵型石榴果醋的澄清度(T)先升后降，2.5 h时果醋的澄清度(T)达到最大值0.96，随后果醋的澄清度(T)开始下降，故选取2.5 h为适宜的处理时间。

图6 处理时间对壳聚糖澄清发酵型石榴果醋的影响

2.2.4 不同pH值对壳聚糖澄清发酵型石榴果醋效果的影响

由图7可知，在一定的壳聚糖添加量、温度和时间条件下，pH值在3.0～5.0范围内时，随着pH值升高，发酵型石榴果醋的澄清度(T)先升后降，在pH值为4时达到最大值0.93，即果醋的澄清度最高。此后随着pH值的升高，果醋的澄清度(T)开始下降，故选取pH 4较适宜。

图7 不同pH值对壳聚糖澄清发酵型石榴果醋的影响

2.3 正交试验

2.3.1 正交试验分析

在单因素试验的基础上，以澄清度(T)为评价指标，壳聚糖用量(A)、处理温度(B)、处理时间(C)、pH(D)为评价因素，利用L9(43)的正交表设计四因素三水平的正交试验，优化壳聚糖的澄清工艺条件，结果见表4；正交试验结果的方差分析见表5。

表4 发酵型石榴果醋壳聚糖澄清条件优化正交试验结果

由表4可知，本次试验的4个因素对发酵型石榴果醋澄清度(T)的影响顺序为A>D>B>C，即壳聚糖用量>pH值>处理温度>处理时间，结合表5的方差分析结果，壳聚糖用量对澄清度的影响差异显著，为主要因素，处理温度、pH值和处理时间的影响差异均不显著。由此得到的最佳工艺组合为A3B3C1D1，即壳聚糖用量为0.3 g/L，温度为30 ℃，时间为1.5 h，pH为4。

表5 方差分析结果

2.3.2 验证试验

方案1是正交试验得到的最佳澄清条件，即壳聚糖用量为0.3 g/L，温度为30 ℃，pH值为4的条件下处理1.5 h。方案2是正交试验表中澄清度(T)最高的方案，即壳聚糖用量为0.3 g/L，温度为30 ℃，pH值为4的条件下处理2 h。因方案1未出现在列表中，正交表中最优方案为方案2，因此需对正交试验结果进行验证，结果见表6。

表6 正交试验结果的验证试验分析

由表6可知，由方案1澄清后的发酵型石榴果醋中的总酸、可溶性固形物、色度、色差均优于方案2，因此，方案1为最佳澄清工艺条件，即在壳聚糖用量0.3 g/L、30 ℃、pH值为4的条件下处理1.5 h为发酵型石榴果醋的最佳澄清条件，与正交试验结果一致。

3 结论

通过对比3种澄清剂(壳聚糖、皂土和明胶)对发酵型石榴果醋澄清度(T)变化的影响，发现壳聚糖是通过在果醋中形成带正电荷的分子，而与果醋中带负电微粒如蛋白质、单宁、纤维素等物质发生絮凝沉淀作用，使醋体得以澄清，且对发酵型石榴果醋的澄清效果优于其他两种澄清剂，因此，壳聚糖为适宜发酵型石榴果醋澄清的澄清剂。

在单因素试验的基础上，以澄清度(T)为指标，通过正交试验得到了壳聚糖的最佳工艺条件：对发酵型石榴果醋澄清度(T)的影响顺序为A>D>B>C，即壳聚糖用量>pH值>处理温度>处理时间，且壳聚糖用量对果醋的澄清效果有显著性，时间、温度、pH值对果醋的澄清效果无显著性。经分析得到最优方案A3B3C1D1，即壳聚糖用量0.3 g/L、30 ℃、pH值4的条件下处理1.5 h，发酵型石榴果醋的澄清度为(T)高达0.98，且经澄清处理后的发酵型石榴果醋清澈透明、口味清新、品质上佳。