类球红细菌对亚硝酸盐和食盐及pH的耐受性研究

赵志平，唐阔，吉莉莉，陈林，韩煦，王卫*

(1.成都大学肉类加工四川省重点实验室，成都 610106；2.四川轻化工大学 化学工程学院，四川 自贡 643000)

腌腊肉制品具有风味独特、加工简单、贮藏期长等特点，深受消费者的喜爱。但腌腊肉制品在加工过程中需要添加亚硝酸盐，对产品的安全带来一定的隐患[1]。消除腌腊肉制品中亚硝酸盐影响的途径较多，如降低亚硝酸盐的使用量、使用亚硝酸盐替代物和利用微生物发酵剂等。李玉邯等利用胡萝卜粉替代亚硝酸盐制作了香肠，结果表明添加0.4%胡萝卜粉替代亚硝酸盐，并添加一定的抗氧化剂，可制作出品质较好且亚硝酸盐含量低的香肠[2]。何丹等利用天然植物提取物替代亚硝酸盐加工了中式培根，产品冷藏至25 d时仍然呈现出良好的质量特性[3]。将添加量为0.1%的天然提取复合物(茶多酚、葡萄籽提取物、番茄红素和维生素E按25∶20∶20∶16比例组合)添加到香肠中，其抑菌效果优于亚硝酸盐[4]。

微生物发酵剂除了可以降低腌腊肉制品中亚硝酸盐的残留，还可以改善产品的品质。阮一凡等以鸭腿为原料，利用植物乳杆菌和酿酒酵母菌作为发酵剂制作了发酵鸭腿，发现混合发酵剂能够提升产品的口感，并且随着贮藏期的延长，发酵剂能显著抑制产品感官的劣变和脂肪氧化以及不良生物胺的产生[5]。王卫等研究发现，微生物发酵剂能够加快风味羊腿的发酵进程，显著抑制脂肪氧化和降低亚硝酸盐残留[6]。杜宝等以巴盟羊肉为原料，添加混合发酵剂制作了发酵香肠，结果发现贮藏阶段发酵剂组香肠的亚硝酸盐残留量为7.993 mg/kg，显著低于对照组的12.493 mg/kg；发酵剂组香肠的TBARS值为0.215 mg/kg，显著低于对照组的0.565 mg/kg[7]。

类球红细菌富含类胡萝卜素、辅酶Q10等天然抗氧化活性物质[8-9]，在食品领域有重要的应用。亚硝酸盐、食盐是加工腌腊肉制品必需的添加剂和辅料，同时肉类的pH呈弱酸性。为探讨类球红细菌在腌腊肉制品中应用的可行性，本研究分析了类球红细菌对亚硝酸盐、食盐和低pH的耐受性，为类球红细菌在腌腊肉制品中的应用提供了初步的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

类球红细菌Rhodobactersphaeroides2.4.1：本实验室保存。

1.2 主要仪器

YP302N型电子天平 上海菁海仪器有限公司；PHS-3C-01型pH计 上海三信仪表厂；水浴恒温振荡器 金坛市金南仪器制造有限公司；HC-2518型台式高速离心机 湘仪设备有限公司；UV-1801型紫外可见分光光度计 北京北分瑞利有限公司；EPED-E2-10TJ型超纯水机 四川优普超纯科技有限公司；756PC型生化培养箱 天津市泰斯特仪器有限公司；DHP-9160B通用型超净工作台 上海舜宇恒平科学仪器有限公司。

1.3 分析方法

1.3.1 类球红细菌的活化与微氧培养

1.3.2 类球红细菌对亚硝酸盐的耐受性分析及生长曲线绘制

1.3.3 类球红细菌在亚硝酸盐胁迫下的生长曲线

1.3.4 类球红细菌对食盐的耐受性分析

1.3.5 类球红细菌在食盐胁迫下的生长曲线

1.3.6 类球红细菌对低pH值的耐受分析

1.3.7 类球红细菌在低pH值下的生长曲线

1.3.8 类球红细菌在亚硝酸盐、食盐和低pH同时胁迫下的生长曲线

2 结果与分析

2.1 类球红细菌对亚硝酸盐的耐受性

亚硝酸盐是腌腊肉制品加工中常用的食品添加剂，具有抑菌、抗氧化等重要作用[12]，从而提高腌腊肉制品的品质和延长货架期。类球红细菌对亚硝酸盐有一定的耐受性，结果见图1。

图1 类球红细菌对亚硝酸盐的耐受性分析

由图1可知，随着亚硝酸盐浓度的增加，类球红细菌生长得越来越慢。与对照组(亚硝酸盐浓度为0 mg/kg)相比，25 mg/kg的亚硝酸盐对类球红细菌的生长没有显著的影响，表明类球红细菌对25 mg/kg的亚硝酸盐有良好的耐受性。亚硝酸盐浓度为50，75，100，150 mg/kg时，类球红细菌的生长速度显著慢于对照组，但50，75，100 mg/kg胁迫的类球红细菌在相同的时间内仍然达到了对数生长期。

100 mg/kg是腌腊肉制品中常使用的亚硝酸盐浓度，为进一步研究亚硝酸盐对类球红细菌生长影响的规律，特绘制了100 mg/kg亚硝酸盐胁迫时类球红细菌细菌的生长曲线，结果见图2。

图2 类球红细菌在100 mg/kg亚硝酸盐下的生长曲线

由图2可知，没有亚硝酸盐胁迫的对照组达到稳定期的时间明显比添加100 mg/kg亚硝酸盐的实验组短，表明对照组菌的生长速度明显快于样品组。对数后期实验组仍可达到和对照组几乎一样的菌落数，说明在亚硝酸盐胁迫的情况下，类球红细菌仍具有较好的生长性能。亚硝酸盐还原酶对类球红细菌耐受和降解亚硝酸盐发挥着决定性作用[13]，但本研究所用的类球红细菌Rhodobactersphaeroides2.4.1基因组中不含有亚硝酸盐还原酶基因，说明该类球红细菌通过其他途径降解亚硝酸盐。此外，类球红细菌在100 mg/kg亚硝酸钠胁迫下的生长速度明显变慢，表明类球红细菌降解亚硝酸盐的能力较弱，后期需要通过驯化和改造进一步提高其降解亚硝酸盐的能力，为发酵剂的开发提供条件。

2.2 类球红细菌对食盐的耐受性分析

一定浓度的食盐能够抑制微生物的生长，但某些微生物却能依靠自身的调控存活于一定浓度的盐水中，表现出较好的耐受性，耐受食盐是微生物发酵剂在腌腊肉制品中应用的前提之一。

由图3可知，随着食盐含量的递增，类球红细菌培养液在660 nm处的吸光值依次减小，并且随着食盐含量逐渐增加，耐受性逐渐减弱。在食盐浓度为2.0%时，类球红细菌的生长虽然受到显著性抑制，但OD660仍然在1.0以上，表现出良好的生长特性。类球红细菌对食盐有一定的耐受性，并且6S RNA和外膜蛋白SspA对耐受食盐胁迫发挥着重要作用[14-15]。在食盐胁迫条件下，类球红细菌的转录组、相容性溶质和膜脂都会发生相应的变化[16]。未来随着腌腊肉制品低盐化，为类球红细菌在腌腊肉制品中的应用创造了有利条件。

图3 类球红细菌在不同食盐含量下的生长

由图4可知，与对照相比，2.5%食盐胁迫下类球红细菌的生长速率变慢，菌体密度有所下降，在稳定期的峰值也较低，生长周期延长，2.5%食盐显著抑制了其生长。但在胁迫条件下，类球红细菌在稳定期的OD660达到了1.12左右，表现出一定适应性。

图4 类球红细菌在2.5%食盐胁迫下的生长曲线

2.3 类球红细菌对pH的耐受性分析

发酵食品在发酵成熟的过程中，由于乳酸菌发酵产酸，食品pH会逐渐降低，抑制有害微生物的生长。pH会影响与菌体生长代谢有关的酶促反应，进而影响发酵的效果，所以发酵剂的耐酸性至关重要。

由图5可知，随着pH的逐渐下降，类球红细菌的生长速度呈现出先升后降的趋势。6.9是类球红细菌正常培养基的pH值，在pH为6.3和6.1时，类球红细菌的生长速度变快但没有显著性差异。pH值继续下降时，类球红细菌的生长变慢，但pH值为5.9时与对照组比没有显著性差异，表明类球红细菌对pH具有较好的耐受性。pH值为5.7时，与对照组相比显示出显著性差异(P<0.05)。pH值为5.5时，类球红细菌不能正常生长。pH对类球红细菌生长的影响与于翠芳等关于pH对金黄色葡萄球菌的影响类似[17]。

图5 类球红细菌在不同pH时的生长

将培养基的初始pH调整为5.8，其他条件不变，探究类球红细菌在pH 5.8时的生长情况。

由图6可知，与对照组相比，类球红细菌在pH 5.8环境下的生长情况与pH 6.9几乎重合，表明类球红细菌在pH 5.8时能正常生长。

图6 类球红细菌在pH 5.8和pH 6.9时的生长曲线

2.4 类球红细菌在亚硝酸盐、食盐和低pH同时胁迫时的生长

与对照组相比，在亚硝酸盐、食盐和低pH共同胁迫下，类球红细菌的延滞期相对延长，达到稳定期的速度变慢，菌体的密度整体下降，说明其生长受到抑制，见图7。

图7 类球红细菌在亚硝酸盐、食盐和低pH同时胁迫下的生长曲线

由图7可知，实验组和对照组均能达到几乎相同的峰值，综合分析得出类球红细菌能在同时含有100 mg/kg的亚硝酸盐、2.5%的食盐和pH 5.8的胁迫条件下较好地生长，说明类球红细菌对亚硝酸盐、食盐和低pH胁迫具有一定的适应能力，为该菌在腌腊肉制品中的应用提供了初步的依据。

3 结论

本研究探索了类球红细菌对亚硝酸盐、食盐和低pH的耐受性。结果显示：类球红细菌分别在100 mg/kg的亚硝酸盐、2.5%的食盐和pH 5.8的胁迫条件下能够良好地生长，对亚硝酸盐、食盐和低pH展现出良好的耐受性。类球红细菌在亚硝酸盐、食盐和低pH同时胁迫的情况下，生长速度变慢，但仍能达到几乎相同的生长峰值。本研究为类球红细菌在腌腊肉制品中的应用提供了初步的依据。