响应面法、BP神经网络优化薏仁米酒产氨基酸态氮

邹立飞，郑鹏

（1.兴义民族师范学院，贵州 兴义 562400；2.云南师范大学，云南 昆明 650500；3.华南农业大学，广东 广州 510642）

薏苡是一种原产于亚洲，兼具食用和药用价值的禾本科植物。2017年薏苡在我国贵州种植面积达到了4.67万公顷，年产优质薏仁米约10.5万吨，贵州薏仁米的主产区是贵州省黔西南州兴仁市，同时兴仁市也被誉为“中国薏仁米之乡”[1]。薏仁米中含薏苡仁酯、神经酰胺、维生素E、蛋白质、类胡萝卜素、核桃酚、多酚（针叶树醇、丁香酸、阿魏酸、丁香酚等）、黄酮类化合物（芹菜素、木犀草素、诺皮素、陈皮素、异黄酮、槲皮素等）多种生物活性成分[2]，使得薏仁米在抗氧化、抗炎症、抗癌、抗糖尿病、抗肥胖、调节肠道微生物群等上都有一定效果[3]。MANOSROIA等[4]通过研究薏仁米提取物对5种人体癌细胞的影响，结果发现薏仁米提取物对5种癌细胞都具有抗增殖能力。CHUNG C等[5]发现薏仁米乙醇提取物对胃癌细胞具有显著的抑制作用，同时证实薏仁米中具有抗氧化活性的酚酸对溃疡有缓解作用。CHOI G等[6]研究发现薏仁米水提取物作用于肥胖雄性小鼠可降低其脂肪积累和血清胆固醇水平，进而控制小鼠的体重。随着消费者对绿色健康营养食品的需求，薏仁米及其相关食品越来越受到消费者的关注。国内薏仁米主要通过蒸煮的方式被食用，但简单的蒸煮在一定程度上限制了薏仁米营养成分的吸收。通过对薏仁米进行加工处理使其有益生物活性成分更易被人体吸收变得很有必要。酿酒作为薏仁米加工的一个重要研究方向也得到消费者的认可。近年来，研究者对薏仁米酒进行了相关的研究。曹冠华等[7]通过正交试验发现初始糖度0.2、初始pH 3、酵母量4%、薏仁∶冬瓜 1∶20（质量比）时，薏仁米酒感官体验最佳。Xu L等[8]发现酵母发酵薏仁米后总酚量、氨基酸量显著增加，同时增强了抗氧化能力、自由基清除活性。黄健等[9]通过响应面法分析得到物料比1∶2.6（质量比）、料液比 1∶2.9（g/mL）、接种量 2.5%、发酵时间 19 d 时，薏仁米酒香味和谐口感佳。现今薏仁米酒主要向保健酒方向发展，氨基酸作为酒中的主要营养物质，氨基酸量在一定程度上反映了酒的营养价值。并且氨基酸赋予酒浓香爽口、鲜美醇和的口感，同时其含量直接影响酒的整体风味和质量等级[10]。扣囊复膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera）是复膜孢酵母属（Saccharomycopsis）的一个种，其可分泌产生β-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、生淀粉糖化酶、酸性蛋白酶等[11]；其中酸性蛋白酶在发酵工业中扮演着重要的角色，在酸性条件下水解蛋白质，释放氨基酸或肽[12]。扣囊复膜酵母与酿酒酵母混合菌种相较于酿酒酵母单菌种发酵可以提高酒中氨基酸含量，增加酒的营养价值[13]。本研究将扣囊复膜酵母（S.fibuligera）A1、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）XY1混合之后用于薏仁米酒的酿造。同时在条件优化研究方面，传统方法一般采用单因素试验，即每次试验只考虑一个因素，虽然单因素试验具有试验设计简便、分析简单等优点；但大多情况下是多因素同时影响，且各因素之间往往存在交互作用，这就导致单因素试验得到的发酵条件很多情况下不为最佳发酵条件[14-15]。因此在条件优化时，不仅要考虑各因素单独作用的效果，同时也需要考虑各因素之间交互作用的效果。响应面优化可以同时考虑各因素单独作用和因素之间的交互作用，因此得到广泛应用。但响应面法主要通过多元二次模型进行优化，对于其他类型的模型的拟合往往表现不佳。人工神经网络（artificial neural network，ANN）最初是由 McCulloh和Pitts于1943年提出的，灵感来自于在神经系统中神经元的生物学特性[16]；多层前馈（back propagation，BP）神经网络是人工神经网络常用的一种，具有自学习、自适应、非线性映射等能力，能对任意复杂的非线性关系进行模拟[17]。

本研究将采用BP神经网络耦合中心组合设计进行优化。薏仁米酒中氨基酸态氮为优化指标，薏仁米与糯米的质量比、混合菌种的接种量、温度、水料比为影响因素，利用BP神经网络对薏仁米酒发酵条件进行优化，以期为薏仁米酒优化寻找新的、更适合的优化方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

扣囊复膜酵母（S.fibuligera）A1、酿酒酵母（S.cerevisiae）XY1：兴义民族师范学院生物与化学学院实验室筛选获得的菌株。

1.1.2 主要原料及试剂

薏仁米：贵州泛亚实业（集团）有限公司；散装糯米：市售；淀粉酶（30 000 U/g）、糖化酶（50 000 U/g）：河南万邦实业有限公司；酵母膏（生物试剂）、蛋白胨（生物试剂）、葡萄糖（生物试剂）、琼脂（生物试剂）、甲醛（分析纯）、氢氧化钠（分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司。

1.1.3 培养基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）液体培养基：酵母膏10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L、pH值自然。YPD琼脂培养基：酵母膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂20 g/L、pH值自然。

1.2 试验方法

1.2.1 种子液制备

挑取扣囊复膜酵母（S.fibuligera）A1、酿酒酵母（S.cerevisiae）XY1接种于不同的YPD琼脂培养基上，均在30℃下培养48 h。从YPD琼脂培养基上挑取单菌落转接于不同YPD液体培养基中，均在30℃下培养48 h，将得到含A1菌株的液体与含XY1菌株的液体等体积混合即为种子液。

1.2.2 工艺流程

1.2.3 氨基酸态氮测定

氨基酸态氮测定采用甲醛滴定法[18]。

1.3 发酵条件优化设计

1.3.1 最陡爬坡试验

在前期单因素试验的基础上，对水料比、薏仁米与糯米质量比、温度、接种量设计合理的步长及变化方向，最终确定氨基酸态氮响应的最佳区间。

1.3.2 中心组合设计（central composite design，CCD）试验

在最陡爬坡试验结果的基础上，将薏仁米∶糯米=2.0∶1（质量比）、接种量6.0%、温度 30.0℃、水料比3.0∶1（mL/g）作为CCD的中心点，同时根据各因素对氨基酸态氮的影响确定各因素的其它水平，CCD试验各因素水平设计见表1。同时应用Design Expert 11.0软件对试验进行设计。

表1 CCD试验水平设计Table 1 Experimental level of central composite design

1.4 统计分析

1.4.1 响应面分析

应用Design Expert 11.0对中心组合试验结果进行分析，得到一个多元二次模型。

式中：Y 为氨基酸态氮量，mg/L；i取 1～4；j取 2～4；n 取 4；Xi、Xj分别为不同因素；a0为常数项；aii、aij为对应自变量系数；ε为误差项。

通过对该模型进行分析，最终得到最大氨基酸态氮含量的理论最优发酵条件及最优值。

1.4.2 BP神经网络分析

BP神经网络结构及模型拟合流程见图1。

图1 BP神经网络结构及模型拟合流程Fig.1 The diagram of a typical BP neural network topology and the process of BP neural network fitting model

BP神经网络是一种信号向前传播、误差逆向传播的神经网络。BP神经网络结构是由输入层、隐含层、输出层构成，层与层之间全部相互连接，而同一层间不存在互连关系（图1a）。BP神经网络算法因具有易行、计算量小、简单、并行性强等优点，在模型模拟仿真上得到广泛的关注。其能通过不断调整神经网络的阈值和权值，使BP神经网络输出值与实际值的误差不断减小，进而改善其拟合效果，具体步骤流程见图1b。

1.5 模型验证及比较

通过对响应面模型、BP神经网络模型分析，进而求得各自模型的理论最大氨基酸态氮及对应的最优发酵条件；在各模型最优发酵条件下对比试验值与理论值是否一致，并计算相对误差。同时通过比较响应面模型、BP神经网络模型的相关系数（R）、决定系数（R2）、均方根误差（root mean square error，RMSE）、绝对平均相对误差（absolute average relative error，AARE）来确定更合适的模型。

2 结果与分析

2.1 最陡爬坡试验结果

最陡爬坡试验设计及结果见表2。通过对最陡爬坡试验中各处理的氨基酸态氮含量的比较分析，确定CCD试验的中心点。

表2 最陡爬坡试验设计及结果Table 2 Experimental results and design of the steepest ascent path

由表2可知，处理1至处理3氨基酸态氮量逐渐增加，但处理3至处理5氨基酸态氮量逐渐减少，处理3条件下氨基酸态氮量最大，因此将处理3作为CCD试验的中心点。同时将响应面优化大致范围确定在处理2至处理4区间。

2.2 CCD试验结果及响应面分析

在最陡爬坡试验结果的基础上，应用Design Expert 11.0软件进行CCD试验设计及试验结果分析。CCD试验设计及结果见表3。二次模型的方差分析见表4。

表3 CCD试验设计及结果Table 3 Experimental results and design of the central composite design

表4 二次模型的方差分析Table 4 ANOVA for quadratic model

由表4可知，模型F值为34.37，相对应的P值小于0.000 1，说明此模型极显著。同时，交互项X1X2差异显著，一次项 X3、X4、交互项 X1X3、X1X4、X3X4、二次项X12、X22、X32、X42差异极显著，且模型的 R2为 0.969 77，说明该模型较准确；并且模型的信噪比为21.425远大于4，说明模型预测精确。通过二次模型方差分析得到模型：Y=-4 454.172 58+48.018 81X1+600.693 36X2+230.247 67X3-10.907 16X4-42.926 03X1X2+45.558 68 X1X3-228.097 94X1X4-4.098 53X2X3+30.483 8X2X4+49.43873X3X4-122.27793X12-39.21948X22-7.291 05X32-216.127 93X42。对该模型求解最优值可知：当薏仁米∶糯米=2.5∶1（质量比）、接种量为 5.7%、温度为30.7℃、水料比为2.6∶1（mL/g）时，理论氨基酸态氮量达到842.1 mg/L。通过验证试验得到实际值为833.3 mg/L，与理论值相差不大。

响应面模型效果图见图2。

图2 响应面模型效果图Fig.2 The effect diagram of quadratic model

由图2可知，在最优条件下，其响应面效果较好。综上所述，通过响应面分析得到的模型具有较好的拟合效果及预测准确性。

2.3 BP神经网络分析

在Matlab 2016a环境下，通过BP神经网络对CCD试验结果进行分析。BP神经网络的主要参数：输入层神经元个数为4，隐含层神经元个数为20，输出层神经元个数为1，最大迭代次数为200；同时BP神经网络的学习率为0.06。BP神经网络模型均方误差效果见图3。

图3 BP神经网络模型均方误差效果图Fig.3 The effect diagram of mean square error of BP neural network model

由图3可知，当迭代次数到3次时，BP神经网络模型的验证集均方误差为0.008 271 1，且此时已经达到训练结束的条件。

BP神经网络模拟仿真效果见图4。

图4 BP神经网络模拟仿真效果Fig.4 The simulation effect of the BP neural network

由图4可知，BP神经网络模型的相关系数达到了0.994 94，说明该模型拟合效果较好。通过对该模型进行最优值求解，发现在薏仁米∶糯米=2.8∶1（质量比）、接种量为4.8%、温度为28.2℃、水料比为2.2∶1（mL/g）时，得到该模型的最大值，即为925.3 mg/L。同时对上述条件下得到的最优值进行验证，最终得到实际值为918.7 mg/L，与理论值基本一致，说明其预测准确性较好。综上所述，说明通过BP神经网络得到的拟合效果及预测准确性均较好。

2.4 BP神经网络与响应面模型比较

通过对BP神经网络模型、响应面模型进行对比分析，确定较优的模型结果见表5。

表5 优化条件和验证结果Table 5 Optimization conditions and validation

由表5可知，响应面模型、BP神经网络模型在其各自模型最优条件下的理论值与试验值的相对误差都较小，但BP神经网络模型的相对误差更小。通过对两种模型的相关系数（R）、决定系数（R2）、均方根误差（root mean square error，RMSE）、绝对平均相对误差（absolute average relative error，AARE）、线性拟合等进行分析，通过分析两种模型的线性拟合效果及预测值与实际值的接近程度，确定在拟合效果上更优的模型，结果见表6、图5及图6。

表6 响应面法与BP神经网络预测能力的比较Table 6 Comparison of predictive capacity of response surface methodology and BP neural network

图5 响应面模型、BP神经网络模型预测值与实际值线性拟合结果Fig.5 Linear fitting for predicted values（response surface methodology model and BP neural network model）with experimental values

图6 响应面模型、BP神经网络模型预测值与实际值比较结果Fig.6 Comparison of predicted values（response surface methodology model and BP neural network model）with experimental values

试验结果显示BP神经网络模型相较于响应面模型的拟合效果更优。综上说明BP神经网络模型在本研究中拟合能力和优化能力更好。

ALRUGAIBAH M等[19]研究发现通过BP神经网络优化蔓越莓果渣花青素的提取条件相较于响应面优化的准确度和精确度都更好。CHOUAIBI M等[20]通过研究响应面法和BP神经网络对瓜蒌籽油产油率进行优化，试验结果显示BP神经网络模型、响应面模型的决定系数（R2）、均方根误差（RMSE）分别为 0.998、0.278 4和0.976 9、0.534 9，说明BP神经网络比响应面具有更好的预测能力。GARG A等[21]采用BP神经网络和响应面法优化海藻油生物柴油生产工艺，BP神经网络、响应面法决定系数分别为0.99、0.96，说明BP神经网络具有良好的可预测性。胡欣颖等[22]通过对比响应面法和BP神经网络在优化松板肉工艺，试验结果表明BP神经网络优化后的成品率更好，误差更小，拟合效果更好。

本研究也表明BP神经网络在预测准确性、拟合效果上都要优于响应面法。综上所述，BP神经网络优化效果均好于响应面法，这可能是因为BP神经网络可以通过误差逆向传播，使误差不断减小，进而预测值无限逼近真值，最终提高模型的拟合效果和预测能力[23-25]。本研究只针对氨基酸态氮量进行研究，但具体薏仁米酒中氨基酸的种类、各种氨基酸的含量及薏仁米酒中的其他有益物质含量有待进一步研究。

3 结论

本研究通过对比响应面、BP神经网络在薏仁米酒中氨基酸态氮量的优化效果，最终发现BP神经网络模型在拟合效果和预测准确性上都优于响应面模型。响应面优化的最佳发酵条件：薏仁米∶糯米=2.5∶1（质量比）、接种量为5.7%、温度为30.7℃、水料比为2.6∶1（mL/g），此时氨基酸态氮的理论值为 842.1 mg/L，实际值为833.3 mg/L，预测值与实际值的相对误差为1.0%；BP神经网络优化的最佳发酵条件：薏仁米∶糯米=2.8∶1（质量比）、接种量为4.8%、温度为28.2℃、水料比为2.2∶1（mL/g），此时氨基酸态氮的理论值为925.3 mg/L，实际值为918.7 mg/L，预测值与实际值的相对误差为0.7%。响应面模型、BP神经网络模型的相关系数（R）、决定系数（R2）、均方根误差（RMSE）、绝对平均相对误差（AARE）分别为 0.984 77、0.969 77、22.759 38、0.031 15 和 0.994 94、0.989 91、13.206 39、0.008 84。综上所述，在本研究中BP神经网络在预测准确性、拟合效果上都优于响应面，BP神经网络对薏仁米酒氨基酸态氮优化效果更好。