河北省黑木耳主产区5种黑木耳的功能性成分及抗氧化性研究

马欣欣，王晨，杨林英，杨嘉雪，张铁军，王谦*

（1.河北大学生命科学院，河北 保定 071000；2.承德市农业环境保护监测站，河北 承德 067000）

黑木耳（Auricularia auricula）又名光木耳，云耳，细木耳，隶属于担子菌门（Basidiomycota）、伞菌纲（Agaricomycetes）、木耳目（Auriculariales）、木耳科（Auriculariaceae）、木耳属（Auricularia），是我国珍贵的食药兼用菌类[1]。黑木耳具有很高的营养和药用价值，不仅含有丰富的黑木耳多糖，还含有多酚和黄酮等功能性成分及 Ca、Mg、Fe、Mn 等微量元素[2-4]。有关研究表明，黑木耳具有抗凝血、提高人体免疫力、抗氧化和延缓衰老、降低血液胆固醇、抗菌作用等多种功能活性[5-9]。近年来，我国黑木耳产业发展迅速，已成为我国栽培量第二大的食用菌品种，据统计，2017年全国黑木耳产量达751.85万吨，约占全国食用菌总产量的20.25%[10]。黑木耳栽培规模的快速提升带来的初级产品的流通压力，必然带来其高附加值食品资源化开发利用的技术需求。

黑木耳中含有多糖、黄酮及多酚等多种抗氧化的活性成分，可调节细胞氧化还原状态，抑制活性氧自由基，从而减少机体的损伤和疾病的发生。在黑木耳的特色食药加工方面，徐田辉等[11]将木耳粉添加到曲奇制作过程中，通过控制配料的添加量，获得了营养价值更高的风味曲奇饼干；何静仁等[12]发明公开了一种含有黑木耳成分治疗糖尿病及高血脂症的药品，可使用者摆脱使用化学药物降糖所带来的副作用；秦丹丹等[13]以黑木耳黑枸杞为原料研发出了一种复合饮料，并证明了复合饮料具有良好的抗氧化活性。本文对相同条件下培养的5个黑木耳品种的子实体进行部分功能性成分的相关检测分析及抗氧化活性比较，为河北省黑木耳主产区品比研究及高附加值食品的开发利用提供了技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本试验所用样品均来自河北省现代农业食用菌产业体系黑木耳产业企业试验站-承德双承生物有限公司。

5个黑木耳样品分别为：黑威15、黑山、青灰小碗、黑厚圆、黑杂19。所用样品均为相同栽培基质下的春耳。

试验试剂均为国产分析纯，试验用水符合GB/T 6682—2008《分析实验室用水规格和试验方法》规定的三级水；乙醇、芦丁、硫酸、葡萄糖、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、没食子酸、福林酚试剂：天津市永大化学试剂有限公司；碳酸钠、2，2′-联氨-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）[2，2′-hydrazine-bis（3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid），ABTS]、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH）：北京索莱宝生物科技有限公司；铁氰化钾、三氯乙酸、三氯化铁、VC：福晨化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

电子天平（JJ224BC）：常熟市双杰测试仪器厂；LD4-2高速离心机：郑州博科仪器设备有限公司；涡旋振荡器（WH-861）：常州市华怡仪器制造有限公司；恒温振荡器（DLHR-Q200）：北京东联哈尔仪器制造有限公司；超声清洗器（KH-5200B）：昆山禾创超声仪器有限公司；722型分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；高速多功能粉碎机（Q-400B3D）：上海冰都电器有限公司；恒温水浴锅（HH-4）：金坛市杰瑞尔电器有限公司；电热恒温鼓风干燥箱：上海飞跃实验仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 黑木耳浸提物的制备

采摘新鲜的黑木耳样品，在50℃恒温干燥箱中烘干至恒重，然后在高速粉碎机中进行粉碎，过50目筛，将处理后的黑木耳粉放于干燥容器中备用[14]。

准确称取3.000 g黑木耳粉放入250 mL锥形瓶中，按1∶25（g/mL）的料液比加入75%的乙醇溶液，在频率40 kHz、功率200 W、温度55℃的条件下超声振荡浸提30 min；过滤后将料液转移至圆底烧瓶中，回流提取1 h；接着进行抽滤，先用提取剂润洗抽滤瓶和布式漏斗，放置滤纸，将冷却后的料液倒入，抽滤后定容，测定浸提液中粗多糖、黄酮及多酚含量。将上述剩余浸提液旋转蒸发至干，得到黑木耳浸提物，将浸提物用75%的乙醇溶液配成不同的质量浓度，测定抗氧化活性。每组试验重复3次。

1.3.2 粗多糖含量测定

黑木耳浸提液中粗多糖含量的测定采用苯酚硫酸法。参考文献[15]制作葡萄糖标准曲线，以去蒸馏水为空白对照，于490 nm波长处测定吸光度，以葡萄糖含量（mg/mL）为横坐标，OD值为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线图，并求出标准曲线回归方程Y=7.151 4X+0.005 8，回归系数R2=0.999 2。精确量取1.0 mL样品溶液，采用和标准曲线制作相同的方法计算样品中粗多糖含量。

1.3.3 黄酮含量测定

黑木耳浸提液中黄酮含量的测定采用亚硝酸钠-硝酸铝法。参考文献[16]制作芦丁标准曲线，以无水乙醇为空白对照，于508 nm波长处测定吸光度，以芦丁浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制芦丁标准曲线图，并求出标准曲线回归方程Y=0.011 3X-0.011 7，回归系数R2=0.998 9。精确量取1.0 mL样品溶液，采用和标准曲线制作相同的方法计算样品中黄酮含量。

1.3.4 多酚含量测定

黑木耳浸提液中多酚含量的测定采用Folin-Ciocalteu比色法。参考文献[17]制作没食子酸标准曲线，以蒸馏水为空白对照，于490 nm波长处测定吸光度，以没食子酸浓度（mg/mL）为横坐标，OD值为纵坐标，绘制没食子酸标准曲线图，并求出标准曲线回归方程Y=0.108 4X+0.031 1，回归系数R2=0.999 1。精确量取1.0 mL样品溶液，采用和标准曲线制作相同的方法计算样品中多酚含量。

1.3.5 ABTS+·清除率测定

将黑木耳浸提物配成不同质量浓度（1 mg/mL～6 mg/mL）的样品溶液备用。配得ABTS储备液：将7 mmol/L的ABTS与2.6 mmol/L的过硫酸钾溶液等体积混合均匀；在使用前用无水乙醇将储备液稀释为在734 nm波长下吸光度2.00±0.10的ABTS工作液。取3 mL ABTS工作液与0.3 mL样品溶液，室温（25℃）下反应6 min，在波长734 nm处测得吸光度为Ax[18-19]；每个浓度平行试验3次，取平均值，根据公式（1）计算黑木耳不同质量浓度浸提物对ABTS+·的清除率。

式中：Ax为样品溶液中加入各工作液的吸光度；A0为蒸馏水代替样品溶液的吸光度；Ax0为蒸馏水代替ABTS工作液的吸光度。

1.3.6 DPPH·清除率测定

参考Zhou等[20]的方法稍作修改，将黑木耳浸提物配成1 mg/mL～8 mg/mL的样品溶液备用，分别取2 mL样品溶液放于具塞试管中，各加入2 mL 100 μmol/L DPPH工作液，放于25℃恒温箱中避光培养30 min，在波长517 nm处测得吸光度为Ay，每个浓度平行试验3次，取平均值，根据公式（2）计算黑木耳不同质量浓度浸提物对DPPH·的清除率。

式中：Ay为样品溶液中加入各工作液的吸光度；A0为无水乙醇代替样品溶液的吸光度；Ay0为无水乙醇代替DPPH工作液的吸光度。

1.3.7 还原力检测

参考邱军强等[21]的方法稍作修改，将黑木耳浸提物配成不同质量浓度（2 mg/mL～10 mg/mL）样品溶液，取1 mL的样品溶液与1 mL磷酸缓冲溶液（0.2 mol/L，pH6.6）和 1 mL 1%铁氰化钾 K3Fe（CN）6溶液混合均匀，在50℃条件下孵化20 min，冷却后加入2 mL 10%的三氯乙酸溶液，振荡混匀，取2 mL的混合液和0.5 mL 0.1%的三氯化铁溶液，静置10 min后迅速在波长700 nm处测得吸光度为Az，每个浓度平行试验3次，取平均值，根据公式（3）计算黑木耳不同质量浓度浸提物的相对还原能力。

式中：Az为样品溶液中加入各工作液的吸光度；A0为蒸馏水代替样品溶液的吸光度；AVC为VC溶液（0.25 mg/mL）代替样品溶液的吸光度。

1.3.8 数据统计与分析

采用SPSS 19.0软件中Duncan式新复极差法，进行差异显著性分析；采用origin9进行数据处理绘制折线图。

2 结果与分析

2.1 黑木耳功能性成分

2.1.1 子实体粗多糖含量对比结果

黑木耳子实体粗多糖含量对比结果见表1。

表1 黑木耳子实体粗多糖含量对比结果Table 1 Comparison of crude polysaccharide content in fruit body of Auricularia auricula

由表1可知，不同黑木耳品种中粗多糖含量不同。在5种黑木耳子实体中，粗多糖介于7.52 g/100 g至10.39 g/100 g，其中黑厚圆粗多糖含量最高达到10.39 g/100 g，与其它4个黑木耳品种中粗多糖含量产生了极显著性差异（P<0.01），青灰小碗与黑山中粗多糖含量差异不显著（P>0.05），黑山与黑杂19之间差异也不显著（P>0.05），其它4个黑木耳品种的黑威15中粗多糖含量相对较少为（7.52±0.26）g/100 g。

2.1.2 子实体黄酮含量对比结果

黑木耳子实体黄酮含量对比结果见表2。

表2 黑木耳子实体黄酮含量对比结果Table 2 Comparative results of flavonoids content in fruit body of Auricularia auricula

由表2可知，不同黑木耳品种中黄酮含量存在差异。在5种黑木耳子实体中，黄酮含量介于3.61mg/100 g至5.92 mg/100 g，其中黑山黄酮含量最高为5.92 mg/100 g，与其他4个黑木耳品种产生了极显著性差异（P<0.01），其它4个黑木耳品种的黄酮含量由多到少依次为青灰小碗、黑厚圆、黑威15、黑杂19，分别为5.08、4.68、4.26、3.61 mg/100 g。

2.1.3 子实体多酚含量对比结果

黑木耳子实体多酚含量对比结果见表3。

表3 黑木耳子实体多酚含量对比结果Table 3 Comparison of polyphenol content in fruit body of Auricularia auricula

由表3可知，不同黑木耳品种多酚含量存在一定差异，黑威15与其它4个品种多酚含量出现极显著性差异（P<0.01），黑山和青灰小碗多酚含量差异不显著（P>0.05），黑厚圆和黑杂19多酚含量差异也不显著（P>0.05）。5种黑木耳子实体多酚含量介于1 025.59 mg/100 g至1 309.87 mg/100 g，黑威15多酚含量最多为1 309.87 mg/100 g，其它4个黑木耳品种的多酚含量由多到少依次为黑山、青灰小碗、黑厚圆、黑杂 19，分别为 1 132.90、1 103.08、1 042.37、1 025.59 mg/100 g。

2.2 黑木耳抗氧化活性

2.2.1 ABTS+·清除率

黑木耳子实体浸提物对ABTS+·的清除率见图1。

图1 黑木耳子实体浸提物对ABTS+·的清除率Fig.1 Scavenging rate of extracts from Auricularia auricula fruit body on ABTS cation free radical

ABTS+·是由过硫酸钾氧化ABTS+产生的一种自由基，当体系中存在氢供体的抗氧化剂时，ABTS+·就会因为发生还原反应而褪色。由图1可知，不同品种黑木耳浸提物的浓度与ABTS+·清除率存在着量效关系，在样品溶液的质量浓度为0～6 mg/mL范围内，5种黑木耳子实体浸提物对ABTS+·的清除率随着样品质量浓度的增加逐渐提高。在样品质量浓度为6 mg/mL时，黑山对ABTS+·的清除率为最大即85%，黑杂19对ABTS+·的清除率最小为70%。采用半数抑制率（IC50）定义为清除自由基达50%时的样品浓度，5种黑木耳子实体浸提物对ABTS+·的清除能力的IC50大小依次为：黑山（IC50=2.246 mg/mL）<黑威 15（IC50=2.509 mg/mL）<青灰小碗（IC50=2.988 mg/mL）<黑厚圆（IC50=3.148 mg/mL）<黑杂 19（IC50=3.524 mg/mL）。

2.2.2 DPPH·清除率

黑木耳子实体浸提物对DPPH·的清除率见图2。

图2 黑木耳子实体浸提物对DPPH·的清除率Fig.2 DPPH·free radical scavenging rate of extracts from Auricularia auricula fruit body

DPPH·在有机溶剂中可稳定存在，溶于乙醇溶液后呈紫红色，且在517 nm处有最大吸收，当体系中的抗氧化剂与DPPH·反应时，颜色变浅，逐渐变为淡黄色，吸光度也逐渐减小，可通过测定溶液的吸光度来判断其清除自由基的效果。由图2可知，在样品溶液的质量浓度为0～7 mg/mL范围内，随着质量浓度的增加，样品对DPPH·的清除率也逐渐提高，并呈现一定的剂量效应。当质量浓度达到7 mg/mL之后，样品对DPPH·的清除率增加缓慢。在样品质量浓度为8 mg/mL时，黑山对DPPH·的清除率达由大到小依次为黑山>黑威15>青灰小碗>黑厚圆>黑杂19。5种黑木耳子实体浸提物对DPPH·的清除能力的IC50大小依次为：黑山（IC50=4.693 mg/mL）<黑威 15（IC50=4.992 mg/mL）<青灰小碗（IC50=5.389 mg/mL）<黑厚圆（IC50=5.694 mg/mL）<黑杂 19（IC50=5.882 mg/mL）。

2.2.3 还原力

黑木耳子实体浸提物的还原力见图3。

图3 黑木耳子实体浸提物的还原力Fig.3 Reducing power of extracts from Auricularia auricula fruit body

还原能力的测定是根据铁氰化钾与抗氧化物质反应，生成亚铁氰化钾，再加入三价铁离子与亚铁氰化钾反应，生成的蓝色物质在700 nm处有较强的吸收，吸光度越大，样品还原能力越强。由图3可知，在质量浓度0～8 mg/mL范围内，5种黑木耳子实体的还原力随着浸提物质量浓度的增加而增加，当浓度超过8 mg/mL时，还原力随着浓度的进一步增大变化趋势变小。当样品质量浓度为10 mg/mL时，5种黑木耳子实体浸提物还原力最强的是黑山达到88%，其次是黑威15还原力为80%，黑杂19还原力相对较低为72%。

3 结论

结果表明，在河北省主产区相同环境条件下栽培的5种黑木耳子实体粗多糖、黄酮、多酚含量及抗氧化活性存在一定差异。5个黑木耳品种子实体中粗多糖含量7.52 g/100 g～10.39 g/100 g，黄酮含量3.61 mg/100 g～5.92 mg/100 g，多酚含量 1 025.59 mg/100 g～1 309.87mg/100g。粗多糖含量最高的品种为黑厚圆，黄酮含量最高的品种为黑山，多酚含量最高的品种是黑威15，表现出生物多样性中种水平上生物活性物质含量的多样性。5个黑木耳品种子实体浸提物均具有有效的自由基清除能力和还原力，黑山的抗氧化性表现最强，其次为黑威15、青灰小碗、黑厚圆、黑杂19。黑木耳子实体浸提物中还含有除粗多糖、黄酮及多酚以外的有关抗氧化成分的活性物质，在以后的试验中应继续深入研究。该项研究也为本岗位团队负责的河北省黑木耳产业体系工作提供了技术支撑，同时，对河北省黑木耳高附加值食品的技术创新具有现实意义。