近红外技术快速测定水冬瓜根皮中紫丁香苷含量

韩忠耀，陈健，宋伟，杨政敏*，唐文双，李仕外

1. 黔南民族医学高等专科学校（都匀 558000）；2. 浙江医药股份有限公司研究院（绍兴 312500）

水冬瓜根皮来源于山茱萸科植物有齿鞘柄木Toricellia angulataOliv. var.intermedia（Harms）Hu的干燥根皮，别名大接骨丹、水五加等，被《贵州省中药材、民族药材质量标准》（2003版）收载[1]。在质量控制方面，针对水冬瓜根皮药材，可采用指纹图谱技术及指标性成分含量测定进行质量控制[2-3]。

近红外光谱（Near infrared spectroscopy，NIR）法是收载于《中华人民共和国药典》的药品质量控制新方法[4]，具有分析速度快、操作简便、无损、绿色等特点，被广泛应用于药品[5-6]、食品[7-8]、农药残留[9]、烟草[10]等领域。与药品经典的检测方法如高效液相色谱法、气相色谱法、紫外-可见分光光度法、化学分析法相比，该方法既可离线快速检测药品中的化学成分或有效成分的含量，又可在线实时动态化开展药品质量监测，且不消耗有机溶剂，是一种绿色、无污染的快速分析新技术与新方法，应用前景广阔。课题组前期通过AOTF-NIR技术建立了水冬瓜根皮总黄酮与浸出物的快速定量分析模型[11]，而关于采用近红外漫反射光谱法快速测定水冬瓜根皮中紫丁香苷含量的研究尚未见报道。

试验拟以水冬瓜根皮为研究对象，通过近红外漫反射光谱法建立快速检测水冬瓜根皮中紫丁香苷含量的NIR模型与快速质量控制方法，为水冬瓜根皮快速质量评价与检测新方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 仪器与设备

Luminar 5030型AOTF-NIR仪（美国Brimrose公司，主要部件包括光学部分、控制部分、电源适配器。软件包括SNAP!光谱处理软件）；The Unscrambler化学计量学分析软件（挪威CAMO公司）；Agilent 1260型高效液相色谱仪（DAD检测器，美国安捷伦科技公司）；FA1004B型电子天平（万分之一，温州瑞昕仪器有限公司）；Sartorius BT25S电子天平（十万分之一，德国塞多利斯公司）；烘箱（天津市泰斯特101-3AB型）；药典筛（绍兴市上虞张兴纱筛厂）；WK-1000A高速粉碎机（潍坊市北方制药设备制造有限公司）；水浴锅。

1.1.2 试药

紫丁香苷对照品（北京盛世康普化工技术研究院，20 mg/支，批号161214）；乙腈（康科德色谱试剂4 L，色谱纯）；磷酸（AR 500 mL，莱阳经济技术开发区精细化工厂）；水为娃哈哈纯净水（浙江娃哈哈集团有限公司）；其他试剂均为分析纯。

1.1.3 样本采集

水冬瓜根皮药材为自采，采集地点为贵州省都匀杉木湖沟渠（经度107°30′52.33″E，纬度26°15′46.16″N，海拔807 m），自采样本均经韩忠耀副教授鉴定为山茱萸科植物有齿鞘柄木Toricellia angulataOliv. var. intermedia（Harms）Hu的根皮。

1.2 方法

1.2.1 样品预处理

取G1～G48批次水冬瓜根皮鲜药材，经烘箱55 ℃烘干，粉碎，过220 μm筛，混匀，即得。

1.2.2 光谱采集方法

应用AOTF-NIR仪SNAP!光谱处理软件建立光谱采集方法。波长扫描范围，1 100～2 300 nm；波长增量，2 nm；测量方式，漫反射；增益调节，×1；样品类型，int. Ref.；数据格式，透过率；扫描方式，比率模式；扫描累计次数，230次。

1.2.3 色谱条件与系统适用性条件

Agela Promosil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm），检测波长220 nm，进样量5 μL，柱温35 ℃，流速1.0 mL·min-1，流动相为0.5%-磷酸溶液（A）-乙腈（B），流动相洗脱条件见表1，流动相洗脱时间30 min。

表1 高效液相色谱流动相洗脱条件

1.2.4 对照品溶液的制备

取适量紫丁香苷对照品，精密称定，加入于25 mL量瓶中，取适量分析纯甲醇，超声溶解，再加入甲醇稀释到刻度，摇匀，得质量浓度为1.622 9 mg·mL-1的紫丁香苷标准品储备溶液[3]。

1.2.5 供试品溶液的制备

取1.2.1小节各批次样品粉末，每份约0.5 g，精密称定，用甲醇回流提取1 h，过滤，滤液分别用0.45μm微孔滤膜过滤，续滤液分别置于液相小瓶中，即得各供试品溶液。

1.2.6 方法学考察

1) 线性关系考察：参照文献[3]方法，分别精密吸取0，0.5，1，2，3，4和5 mL 1.2.4小节的对照品储备液于10 mL量瓶中，用甲醇稀释到刻度，按1.2.3小节色谱条件进行分析。

2) 精密度、稳定性及重复性试验：参照文献[3]。

3) 加样回收率试验：取6份已知含量的G1批次药材提取液，精密加入适量紫丁香苷对照品溶液进行试验。

1.3 NIR光谱预处理与数据处理

采用Excel软件对紫丁香苷含量检测理化值进行处理。利用美国Brimrose公司SNAP!光谱处理软件，对NIR光谱进行预处理。利用挪威CAMO公司The Unscrambler化学计量学分析软件关联NIR光谱与紫丁香苷理化数据，构建NIR定量PLS分析模型。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 线性关系考察结果

以紫丁香苷质量分数为横坐标，以紫丁香苷HPLC峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，线性方程为Y=6 814.4X-11.501，线性相关系数r=0.999 6，结果表明线性考察结果良好。

2.1.2 其他方法学考察结果

由表2可知，仪器的精密度与方法的重复性良好，同时供试品在36 h内，稳定性δRSD小于3%，表明供试品36 h内的稳定性良好。

表2 方法学考察试验结果

2.1.3 加样回收率试验

结果表明，紫丁香苷的平均加样回收率为103.18%，且δRSD为2.72%，表明所建立的方法回收率良好。

2.2 NIR扫描结果

48批次水冬瓜根皮药材近红外漫反射光谱图见图1。

图1 48批次水冬瓜根皮药材NIR光谱图

2.3 近红外定量校正模型的建立与验证

2.3.1 校正集与验证集的确定

将42批次水冬瓜根皮药材作为校正集（G1～G42），6批次作为验证集（G43～G48）。

2.3.2 近红外光谱预处理方法的选择

为更好地建立水冬瓜根皮紫丁香苷近红外快速质量评价定量分析模型，通过相关系数（R）、校正均方根误差（RMSEC）、预测均方根误差（RMSEP）、预测相对偏差（RSEP）来考察模型性能。R越接近1表示模型的预测值与标准对照方法分析值之间的相关性越好；RMSEC和RMSEP的大小与样品化学值相关，这两个参数越小越接近，则表明模型性能越佳，预测精度越高；同时，RSEP越小越佳。不同光谱预处理方法见表3。

表3 不同光谱预处理方法对定量校正模型性能的影响

2.3.3 近红外建模波段的选择

根据表3，“Add constant+Smooth”为光谱的相对较佳预处理方式，为更好地降低冗余信息及降低噪声干扰，采用Add constant+Smooth优化水冬瓜根皮药材中紫丁香苷含量测定最佳波段，波长优化条件见表4。

从表4可以看出，在1 100～2 200 nm波段，紫丁香苷近红外校正模型的RMSEC与RMSEP相对较小且比较接近，相关系数R无显著性差异，RSEP值最小，因此，结合表3和表4，最终确定NIR光谱预处理方式：1 100～2 200 nm波段下，采用Add constant+Smooth预处理NIR光谱，构建水冬瓜根皮药材紫丁香苷含量NIR快速定量分析模型。

表4 近红外光谱波段优化

2.3.4 紫丁香苷NIR定量校正模型的建立

按照2.3.2与2.3.3小节的建模优化条件，将42批次水冬瓜根皮样本作为校正集（G1～G42），6批次作为验证集（G43～G48），选择1 100～2 200 nm波段，采用Add constant+Smooth方式对NIR原始光谱进行预处理，导入The Unscrambler化学计量学分析软件，将G1～G42的光谱信息与样品紫丁香苷含量理化参考值进行数据关联，建立水冬瓜根皮样本的紫丁香苷的偏最小二乘法（PLS）NIR校正集定量分析模型。结果显示：RMSEC=0.935 9，RMSEP=1.191 0，RSEP=0.142 7，R=0.983 6。紫丁香苷的实测值与预测值的Matrix Plot图见图2，紫丁香苷预测值与真实值相关图见图3。

2.3.5 模型验证

将水冬瓜根皮验证集样本G43～G48的NIR原始光谱经2.3.2与2.3.3小节的建模优化条件预处理后的uns格式光谱数据，导入The Unscrambler化学计量学分析软件，对6批次样品进行模型预测，紫丁香苷定量模型的绝对误差见表5，表明所建模型验证效果较好。

图2 水冬瓜根皮的紫丁香苷预测值与真实值Matrix Plot图

图3 水冬瓜根皮的紫丁香苷预测值与真实值相关图

表5 紫丁香苷模型预测结果

3 讨论

紫丁香苷为水冬瓜根皮中的有效成分[12]，试验通过近红外光谱法建立了其快速、无损、绿色的NIR定量分析模型，模型经验证预测结果理想。近红外光谱法不仅可以用于水冬瓜根皮中紫丁香苷的含量测定，也可用于其真伪鉴别[13-15]。通过主成分分析（PCA）法建立正品水冬瓜根皮样本的NIR模型，可以快速对伪品及掺杂品进行快速定性判别分析，同时可采用正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）等化学计量学方法对其进行综合质量评价，相关问题有待进一步深入研究。

4 结论

试验以黔产水冬瓜根皮药材（Toricellia angulataOliv. var. intermedia（Harms）Hu）为研究对象，通过近红外漫反射光谱法与理化参考值数据关联，应用挪威CAMO公司The Unscrambler化学计量学分析软件，构建了水冬瓜根皮药材中紫丁香苷含量快速定量分析最小二乘（PLS）法近红外光谱模型。该模型验证回收率高，相对误差反映模型预测值与理化参考值的可信程度较高，实现了对水冬瓜根皮药材无损、绿色、快速质量评价，为黔产水冬瓜根皮中紫丁香苷快速分析提供了一种新方法，同时为食品、烟草、粮食、药品等快速、绿色、无损检测与分析提供借鉴与参考。

综上所述，试验所建立的NIR快速检测方法稳定、可靠、简便，可用于水冬瓜根皮中紫丁香苷含量的快速检测，生产实际应用前景广阔，为其快速质量控制与评价提供参考与思路。