土茯苓提取物的抗氧化性和酪氨酸酶激活作用

张岩，梁松杰，王文君*，张悦

遵义医科大学珠海校区生物工程系（珠海 519041）

土茯苓为百合科多年生草本植物光叶菝葜（Smilax glabraRoxb.）的干燥根茎，主要产于我国华南、中南地区。其味甘、淡、平，归肝、胃经，具有解毒、除湿、通利关节等功效[1]，也表现出一定的抗菌、抗炎、镇痛的作用[2-4]，可用于治疗银屑病、痛风、高尿酸血症等疾病[5-7]。近几年，对于土茯苓的抗氧化作用也有研究[8]，但报道不多。

酪氨酸酶是机体产生黑色素的关键限速酶，其活性降低或失去有可能引发白斑、白癜风等[9-10]疾病，但关于土茯苓提取物对酪氨酸酶的影响作用未见报道。

因此，试验研究土茯苓的体外抗氧化活性与酪氨酸酶激活作用，旨在拓展土茯苓的应用范围，深入开发其药用价值。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

ABTS 2, 2’-联氨-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨盐、DPPH（1, 1-二苯-2-苦基肼）、Levo-DOPA（L-多巴）（上海麦克林生化科技有限公司）；VC（西陇科学股份有限公司）；其他试剂均为国产分析纯；酪氨酸酶，自提于新鲜土豆；土茯苓，购自珠海东咀济生医药。

1.2 试验仪器与设备

UV-2600紫外-可见分光光度计（日本岛津）；超声波清洗仪（上海同天生物技术股份有限公司）；旋转蒸发仪（Hei-VAP，德国Heidolph公司）；高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.3 试验方法

1.3.1 土茯苓提取物的制备

称取20.00 g土茯苓粗粉，加入100 mL无水乙醇过夜浸泡，在80 ℃条件下，超声提取30 min，抽滤，重复提取1次。滤液在50 ℃条件下减压旋蒸至黏稠浸膏。

1.3.2 土茯苓提取物抗氧化活性测定

1.3.2.1 土茯苓粗提液制备

精密称取100.00 mg浸膏置50 mL容量瓶中，加入甲醇定容至50 mL，得到初浓度为2.0 mg/mL土茯苓溶液，在4 ℃冰箱冷冻保存。

1.3.2.2 DPPH法

DPPH试剂的制备。精密称取3.40 mg的DPPH，用甲醇溶解并定容至100 mL，其质量浓度为0.034 0 mg/mL，避光保存。

VC对照品溶液的制备。精密称取48.00 mg的对照品VC，用甲醇溶解并定容至100 mL，其质量浓度为0.480 mg/mL。

抗氧化活性测定。参考文献[8]的方法，移取6组样品溶液，各0.50 mL，置于10 mL试管中，向其中加入4 mL的DPPH试剂，振摇，室温避光反应30 min。在516 nm处测定吸光度A，绘制清除率曲线。样品质量浓度分别为2.2，6.7，11.0，16.0，20.0和24.0 mg/mL。以VC做对照。

式中：A0为未加入样品的DPPH甲醇溶液，即空白组的吸光度；Ai为加入样品溶液与DPPH试剂反应后的吸光度；Aj则是样品本身的吸光度。

1.3.2.3 ABTS法

ABTS+试剂制备。参考文献[8]的方法，精密称取96.3 mg的ABTS+和16.56 mg的K2S2O8配制成7.00 mmol/L的ABTS+水溶液和2.45 mmol/L的K2S2O8水溶液，按1︰1混合，室温避光反应12 h以上，即得浓度3.5mmol·L-1的ABTS+工作液。试验前吸取1.32 mL的工作液，用甲醇稀释定容至50 mL，得到浓度为0.092 5 mmol/L的ABTS+试剂。

抗氧化活性测定。分别移取6组样品溶液，各100 mL，置于10 mL试管中，再向其中加入3 mL的ABTS+试剂，振摇，在室温条件下避光反应30 min。试剂空白、VC做对照，在750 nm处测定吸光度A，绘制清除率曲线。样品质量浓度分别为8.4，9.7，11.0，12.0和14.0 mg/mL。

式中，A0为未加入样品的ABTS+甲醇溶液，即空白组的吸光度；Ai为加入样品溶液与ABTS+试剂反应后的吸光度，Aj则是样品本身的吸光度。

1.3.3 土茯苓提取物影响酪氨酸酶活性的分析

1.3.3.1 酪氨酸酶液制备

参考文献[11]方法，试验前12 h将新鲜土豆去皮切块，取16 g冷藏于-20 ℃冰箱保存；试验当天将保存的土豆置于匀浆机中，加入100 mL的PBS（pH 6.8的磷酸盐缓冲溶液）溶液，匀浆2 min；过滤，滤液在4 ℃，按4 000 r/min离心10 min，取上清液备用，即为酪氨酸酶溶液。

1.3.3.2 多巴溶液的制备

精确称取0.078 g的多巴固体药品，加入90 mL的PBS溶液溶解并转移至100 mL容量瓶中定容至刻度线，即得到多巴溶液以备用。

1.3.3.3 活性分析

参考文献[11]，根据表1的方法，向试管中加入多巴溶液、样品溶液和PBS溶液，混合均匀后于35 ℃进行水浴加热10 min，加入酪氨酸酶再水浴加热10 min，土茯苓样品溶液的质量浓度分别为0.1，0.2，0.3，0.4和0.5 mg/mL，在475 nm进行吸光度A的测定，计算激活率，绘制激活率曲线。

表1 土茯苓对酪氨酸酶活性作用体系溶液配制表单位：mL

1.3.4 统计学方法

采用SPSS 21.0统计软件处理数据，相对应的各组数据均采用均数±标准差表示，即x±s，得到图表结果，并进行显著性差异计算。

2 结果与分析

2.1 土茯苓提取率

得到土茯苓浸膏2.376 g，产率为11.88%。

2.2 土茯苓提取物抗氧化活性测定结果

2.2.1 土茯苓提取物对DPPH自由基的清除能力

从图1可以看出，土茯苓提取物和VC对DPPH自由基的清除能力均随质量浓度增大而增强，表现出剂效依赖性，且具有很好线性关系，相关性在0.99以上，半数抑制率IC50值分别为（13.55±0.55）mg/mL和（3.0±0.009 5）mg/mL，具有统计学意义（p＜0.001）。土茯苓具有较好的抗氧化能力，但稍弱于对照品VC，约为VC的1/4，见表2。6组不同质量浓度样品对DPPH自由基的清除能力两两比较，均具有显著性差异，具有统计学意义，见表3。

图1 土茯苓提取物及VC清除DPPH自由基的线性关系图（n=3）

表2 土茯苓提取物及VC清除DPPH自由基的线性关系（n=3）

表3 土茯苓提取物对DPPH自由基的清除率（n=3）

2.2.2 土茯苓提取物对ABTS+自由基的清除能力

从图2可看出土茯苓提取物和VC对ABTS+自由基的清除能力均随质量浓度增大而增大，同样表现出剂效关系，且具有一定线性关系，相关性为0.978 5和0.996 2，IC50值分别为（11.07±0.37）mg/mL和（2.40±0.046）mg/mL，具有统计学意义（p＜0.001）。土茯苓具有较好抗氧化能力，但还是稍弱于对照品VC，约为VC的1/5，见表4。且5组不同质量浓度样品对ABTS+自由基的清除能力两两比较，均具有显著性差异，具有统计学意义，见表5。

图2 土茯苓提取物及VC清除ABTS+自由基的线性关系图（n=3）

表4 土茯苓提取物及VC清除ABTS+自由基的线性关系（n=3）

2.3 土茯苓提取物对酪氨酸酶活性的影响

从图3可看出，土茯苓提取物对酪氨酸酶具有一定激活作用，且激活作用随着样品质量浓度增大而逐渐增强，表现出较好剂效关系，相关性在0.96以上，土茯苓提取物浓度为（0.38±0.13）mg/mL，酪氨酸酶激活率达到50%，见表6。但土茯苓浓度较低时，却表现出微弱的酪氨酸酶抑制作用，发现土茯苓质量浓度在0.10 mg/mL以上就表现出明显的对酪氨酸酶激活作用。

表5 不同质量浓度土茯苓提取物对ABTS+自由基的清除率比较（n=3）

图3 土茯苓提取物激活酪氨酸酶活性的线性关系图（n=3）

表6 土茯苓提取物对酪氨酸酶活性的影响（n=3）

3 结论

土茯苓提取物具有较好的抗氧化能力，可以显著清除DPPH自由基和ABTS+自由基，IC50值分别为（13.55±0.55）mg/mL和（11.07±0.37）mg/mL。土茯苓提取物对酪氨酸酶具有激活作用，其浓度为（0.38±0.13）mg/mL时，酪氨酸酶激活率达到50%，试验结果为土茯苓的深入开发提供数据支持，为拓展土茯苓在抗氧化和因酪氨酸酶活性降低而引起的色素缺失性疾病的治疗提供可能性。