壳寡糖对花椒干腐病菌的抑菌活性研究

高雨萌，费昭雪，史健飞，阮钊，李培琴

(西北农林科技大学林学院，西部森林生物灾害治理国家林业和草原局重点实验室，陕西杨凌 712100)

花椒Zanthoxylum bungeanum是芸香科Rutaceae花椒属落叶小乔木或灌木，原产于中国，为世界范围内主要的经济栽培植物。它以耐干旱、耐瘠薄、适应性强、寿命长、分布广、管理方便等优势，成为干旱、半干旱及丘陵地区发展农村商品经济的重要经济树种。花椒产业投资小、见效快、效益高，已成为农民增收的重要途径[1－2]。但是，花椒病害的发生严重制约了我国花椒产业的发展，尤其是花椒干腐病，该病又称流胶病。早在20世纪80年代就已经发现，花椒干腐病能引起中国北方多个花椒品种的树干和枝条腐烂坏死，病害严重发生时，可造成整株花椒树的死亡[3－4]。曹支敏 等[3]采用形态学方法将花椒干腐病菌鉴定为Fusarium sambucinum。周雪等通过对我国花椒主要栽培区的干腐病进行系统的调查，结合形态学和分子生物学方法鉴定了2种新病原菌Fusarium zanthoxyli和Fusarium continuum，且发现F.zanthoxyli是引起我国陕甘等花椒主产区干腐病的主要病原菌[5]。目前，对花椒干腐病的防治主要采用化学防治[6]。尽管化学农药在植物病害防治方面表现出一定的优势，但是由于不合理使用带来的环境污染、农药残留、有害生物抗药性等问题也日益严重。近年来，随着经济文化水平的不断提高，为了保障农产品质量和人畜安全，保护农林业生产及生态环境，开发绿色环保的生物农药显得日趋重要。

壳寡糖(oligochitosan)是由β－1，4－糖苷键连接的2－氨基葡萄糖组成的聚合度为2～20的寡糖，也被称为氨基寡糖素或几丁寡糖，由壳聚糖降解而形成，是天然糖类物质中唯一大量存在的碱性氨基多糖，水溶性好，易吸收[7]。近年来，壳寡糖作为生物农药在防病和抗病方面倍受重视。壳寡糖对不同植物病原真菌的抑菌活性已被广泛研究，如抑制植物病原真菌的生长、降低其产孢能力、抑制其孢子萌发和减小孢子萌发形成的芽管长度，从而降低植物病害的病情指数[8－10]。此外，壳寡糖还能作为诱导剂，激发植物的防御反应，如诱导植物抗病相关酶活性的增强，或提高植物体内抗病相关物质如酚类化合物的合成[11－12]。如赵小明 等[13]发现2%的氨基寡糖的300倍液对苹果花叶病的田间防治效果可达93.85%；沈奕等[14]发现壳寡糖对烟草黑胫病的盆栽防治效果可达57.81%；蔡明[15]报道了3%的氨基寡糖素对冰葡萄霜霉病具有显著的防治作用，防效可高达80%。李培琴等[16]研究壳寡糖对花椒干腐病菌F.sambucinum的抑菌活性，发现壳寡糖对F.sambucinum的生长具有较强的体外抑制活性。目前尚不清楚壳寡糖对干腐病的主要病原菌F.zanthoxyli是否具有抑菌活性，对我国花椒主产区干腐病是否具有防治效果。因此，笔者测试壳寡糖对干腐病菌F.zanthoxyli的菌落生长和孢子萌发的影响，基于温室盆栽和人工接种系统研究壳寡糖对花椒干腐病的盆栽防治效果，以期为壳寡糖在花椒干腐病防治中的开发利用及花椒病害的无公害防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 花椒干腐病菌Fusarium zanthoxyli由西北农林科技大学林学院森林病理实验室周雪博士提供，已进行形态学和分子生物学鉴定[5]，保存在－80℃超低温冰箱中。取出后，接种于马铃薯葡萄糖琼脂(Potato dextrose agar，PDA)培养基上进行活化培养5～7 d，培养条件为(25±2)℃，暗培养；活化培养2～3次后的菌种作为供试病原菌。

1.1.2 供试植物 花椒品种为‘凤县大红袍’，来源于国家林业和草原局花椒工程研究中心(凤县花椒试验示范站)，以营养土和蛭石(约5∶1)为基质进行盆栽种植。花椒植株均为2 a生盆栽苗，置于(25±1)℃，每天光照12 h的学校温室内培养。

1.1.3 供试试剂 壳寡糖(平均分子量3 000 Da，脱乙酰度为90%)，购买自青岛博智汇力公司；PDA培养基干粉，购买自北京索莱宝科技有限公司；台盼蓝，购买自江苏酶标生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 壳寡糖对花椒干腐病菌菌落生长的影响采用菌落生长抑制法测定壳寡糖对花椒干腐病菌F.zanthoxyli生长的影响[17]。 用滤膜(0.45 μm孔径)过滤除菌的方法配制1.0 mg/mL无菌的壳寡糖母液，然后用移液器吸取一定体积的壳寡糖母液加入约50℃尚未凝固的PDA培养基中，配制壳寡糖终质量浓度分别为 0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/mL的培养基，混匀，倒平板，待其凝固后备用。用无菌打孔器在PDA培养基培养7 d的F.zanthoxyli菌落边缘打孔，制备直径5 mm菌饼，接种到含有不同质量浓度壳寡糖的PDA培养基平板中央，每皿接种1个菌饼，以无菌水为对照，每个质量浓度重复3次。25℃恒温箱内暗培养，分别于接种后4，8，12，16 d采用十字交叉法测量各处理菌落直径，计算抑菌率。

抑菌率(%)＝(对照组菌落直径－处理组菌落直径)/(对照组菌落直径－菌饼直径)×100

1.2.2 壳寡糖对花椒干腐病菌孢子的致死作用分析

1.2.2.1 准备病菌孢子悬浮液 用无菌打孔器在PDA培养基上培养7 d的花椒干腐病病原菌菌落靠近边缘打孔制备菌饼，用无菌牙签将菌饼转移至新制备的PDA培养基平板上，置于25℃恒温箱内暗培养7 d后，添加5 mL无菌水溶液，用无菌棉签轻轻擦拭菌落表面制备孢子悬浮液。用移液器将孢子悬浮液转移至无菌离心管内，采用血球计数器在显微镜下检测孢子悬浮液的浓度，调整孢子悬浮液的中浓度为105个/mL左右，备用。

1.2.2.2 壳寡糖与病菌孢子的共培养 准备若干无菌离心管，分别加入500 μL浓度为105个/mL的孢子悬浮液，再向孢子悬浮液中加入10 μL系列质量浓度梯度的壳寡糖溶液，分别配制终质量浓度为0.1， 0.2， 0.3， 0.4， 0.5， 0.6， 0.7， 0.8， 0.9，1.0 mg/mL的壳寡糖溶液，以无菌水作为对照，每个处理3个重复。盖上离心管盖子，用封口膜再将离心管盖子包裹，在25℃，250 r/min条件下共培养。

1.2.2.3 检测病菌孢子存活情况 采用台盼蓝染色法分析经壳寡糖处理后的花椒干腐病菌孢子的活力[18]。死亡孢子被台盼蓝染色为蓝色，存活孢子不被台盼蓝染色。分别检测共培养24 h和48 h的孢子致死率。取90 μL经壳寡糖处理的孢子悬浮液于1.5 mL离心管中，加入4%台盼蓝染液10 μL，混匀，室温下染色5～10 min，取孢子悬浮液制临时玻片在显微镜下观察，每个处理计数500个孢子，记录其中被染为蓝色的孢子数，每个处理重复5次。

致死率(%)＝(被染为蓝色的孢子个数/500)×100

1.2.3 壳寡糖对F.zanthoxyli孢子萌发的影响壳寡糖培养基平板的配制同1.2.1。病菌孢子悬浮液的制备同1.2.2.1。取250 μL孢子悬浮液置于壳寡糖培养基平板表面，用无菌玻璃铲均匀涂抹，封口，置于25℃暗培养。以无菌水为对照，处理和对照各设3个重复。培养24 h和48 h后，光学显微镜下观察孢子和芽管的形态，统计孢子萌发率。每个培养皿随机取5个视野，每视野萌发孢子占观察总孢子的比例为萌发率。孢子初生芽管长度超过孢子体一半即视为萌发[19]。

1.2.4 壳寡糖对盆栽花椒苗干腐病的防治试验采用针刺接种法[5]。用无菌打孔器在PDA培养基培养7 d的花椒干腐病病原菌菌落上制备直径5 mm菌饼，作为接种菌源。选用2 a生健康花椒盆栽苗，在花椒茎秆上中下部位选取直径约为5 mm的圆形接种位点3个，用无菌尖口镊子在每个接种位点上制造8～10个微伤口，接种病菌菌饼，用5 cm×3 cm无菌脱脂棉块包裹，用移液器滴加2 mL过滤除菌后的壳寡糖溶液在脱脂棉块上。根据1.2.1、1.2.2和1.2.3的试验结果，壳寡糖溶液的质量浓度设置为0.25 mg/mL和0.50 mg/mL，分别标记为Ocs-0.25＋Fz和Ocs-0.50＋Fz；以滴加相同体积的无菌水处理为阴性对照，标记为Fz；以刺伤不接种干腐病菌和无菌水处理作为空白对照，标记为CK。进一步用保鲜膜包裹缠绕脱脂棉以便保持伤口湿度，每处理10株花椒苗。接种花椒苗放置于25℃，每天光照12 h的植物温室中培养，14 d后撕去保鲜膜和脱脂棉，分析各处理的干腐病病斑大小。病斑大小按椭圆计算病斑面积，通过病斑面积计算各处理对花椒干腐病的防治效果。

防治效果(%)＝(对照组病斑面积－处理组平均病斑面积)/对照组病斑面积×100

1.3 数据分析 采用SAS 8.0对试验数据进行统计分析，采用最小显著差异法(LSD)检验各试验数据之间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 壳寡糖对花椒干腐病菌菌落生长的影响 壳寡糖对花椒干腐病菌菌落的生长具有一定的抑制作用(图1)。随着壳寡糖质量浓度的增加抑菌率增加，随着培养时间的延长抑菌率呈现先增后降的趋势(表1)。不同培养时间(除第4天)，质量浓度为0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL 的壳寡糖溶液处理间抑菌率差异不显著，均显著高于0.2 mg/mL壳寡糖溶液处理(P<0.05)；可见壳寡糖使用的最适质量浓度为0.4～0.6 mg/mL。5个质量浓度的壳寡糖处理对病菌菌落的抑制率均在第8天达到最大；除0.2 mg/mL壳寡糖溶液处理外，其它处理的抑菌率均显著高于其它3个时间点的抑菌率(P<0.05)，且在第12天时抑制率仍可达44%～50%，说明壳寡糖具有较长的持效时间。

图1 花椒干腐病菌在壳寡糖处理第8天时的菌落Fig.1 Colony of Fusarium zanthoxyli on the 8 th day treated by oligochitosan

表1 壳寡糖对花椒干腐病菌菌落生长的抑制率Tab.1 Inhibitory rate of oligochitosan against the colony growth of Fusarium zanthoxyli

2.2 壳寡糖对花椒干腐病菌孢子的致死作用 壳寡糖处理花椒干腐病菌孢子24 h后经显微观察发现，壳寡糖对花椒干腐病菌的孢子具有一定的致死作用，而且随着壳寡糖质量浓度的增加，致死作用增强，当质量浓度达到0.8 mg/mL及以上，花椒干腐病孢子几乎全被杀死(图2)。

图2 台盼蓝染色法显微观察壳寡糖处理24 h后的花椒干腐病菌孢子Fig.2 Microscopic observation of spores of F.zanthoxyli treated by oligochitosan for 24 hours using trypan blue staining

不同质量浓度的壳寡糖溶液与花椒干腐病菌孢子共培养24 h和48 h的致死率见图3。壳寡糖对花椒干腐病菌孢子的致死率随壳寡糖质量浓度的升高而增加。在24 h处理下，当壳寡糖质量浓度达到0.7 mg/mL时孢子死亡率达到100%；在48 h处理下，壳寡糖质量浓度为0.6 mg/mL时孢子死亡率就几乎达到100%。

图3 壳寡糖对花椒干腐病菌孢子的致死率Fig.3 Lethality rate of oligochitosan to spores of Fusarium zanthoxyli

2.3 壳寡糖对花椒干腐病菌孢子萌发的影响 花椒干腐病菌孢子在壳寡糖处理12 h后的萌发状态见图4。随着壳寡糖质量浓度的增加，干腐病菌孢子萌发数量减少，芽管变短。当壳寡糖质量浓度为0.5 mg/mL，F.zanthoxyli的孢子几乎不萌发；而CK处理的孢子几乎全部萌发，且芽管很长。

图4 壳寡糖处理后12 h花椒干腐病菌孢子萌发情况Fig.4 Spore germination of Fusarium zanthoxyli treated by oligochitosan for 12 h

F.zanthoxyli孢子在壳寡糖终质量浓度分别为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/mL 的培养基平板上培养12 h和24 h时，孢子萌发率随壳寡糖质量浓度的升高而降低，芽管生长长度显著缩短(表2)。尽管质量浓度为0.1 mg/mL的壳寡糖培养基上培养12 h和24 h时，孢子萌发率均与对照差异不显著(P>0.05)，但是其芽管的生长长度显著低于对照(P<0.05)；随着壳寡糖质量浓度升高，花椒干腐病菌孢子萌发的芽管长度缩短更加显著(表2)。

表2 壳寡糖对花椒干腐病菌孢子萌发的影响Tab.2 Effect of oligochitosan on spore germination of Fusarium zanthoxyli

2.4 壳寡糖对花椒盆栽苗干腐病的防治效果 刺伤不接种F.zanthoxyli(CK组)的花椒枝干上，只留有针刺留下的微伤口；刺伤接种F.zanthoxyli(Fz组)的花椒枝干上形成大型腐烂病斑，并伴随着大量的流胶；刺伤接种F.zanthoxyli且经壳寡糖处理(Ocs＋Fz组)的花椒枝干虽然也有病斑形成，但是病斑显著小于Fz组，病斑下陷，稍有腐烂，稍有或没有流胶(图5)。Ocs-0.25＋Fz组和Ocs-0.50＋Fz组的病斑平均面积均显著小于Fz组的病斑面积(表3)。分析壳寡糖对花椒干腐病的盆栽防治效果发现，0.25 mg/mL壳寡糖的防治效果显著低于0.5 mg/mL壳寡糖的防治效果(P<0.05)。

图5 不同处理下花椒干腐病的症状Fig.5 Symptoms of stem canker of Zanthoxylum bungeanum under different treatments

表3 壳寡糖对花椒盆栽苗干腐病的防治作用Tab.3 Control effect of oligochitosan on stem canker of Zanthoxylum bungeanum potted seedlings

3 结论与讨论

壳寡糖对植物病害的防治作用机制之一是壳寡糖能直接抑制病原菌的生长。壳寡糖的抑菌功能已经在多种植物病原菌中取得了深入的研究进展，如Botrytis cinerea[10]、Phytophthora capsici[20]、Alternaria kikuchian[21]和Rhizopus stolonifer[22]等。植物病原真菌菌落生长速度能反映该病菌的繁殖扩展能力，通过研究壳寡糖对花椒干腐病菌F.zanthoxyli在人工培养基上菌落生长的影响，发现壳寡糖能显著地抑制花椒干腐病菌F.zanthoxyli菌落的生长，且随着壳寡糖质量浓度的增加抑菌活性增强，当壳寡糖质量浓度在0.4～1.0 mg/mL之间处理干腐病菌8 d，抑菌率可达66%～74%。植物病原真菌孢子在植物病害循环中是病害侵染的重要来源，开发能杀死植物病原真菌孢子的生物农药对控制植物病害具有重要的意义。本研究中，使用0.7 mg/mL的壳寡糖溶液与F.zanthoxyli孢子共培养24 h后，孢子死亡率可达100%，当壳寡糖质量浓度为0.6 mg/mL，共培养48 h后孢子死亡率几乎100%，壳寡糖对F.zanthoxyli孢子具有致死作用。植物病原真菌孢子萌发是病原侵染植物的重要环节，如果真菌孢子不能萌发，则会大大的降低植物病害的发生[23]。本试验中，发现壳寡糖能显著地降低F.zanthoxyli孢子的活力，抑制孢子的萌发及芽管的伸长。壳聚糖也具有一定的抑菌活性，但是由于其分子量较大、黏度高、不溶于水等特性，导致其生物活性低于壳寡糖[24]。壳寡糖分子量小、水溶性好、易降解，并能进入植物细胞内进行调节，壳寡糖在植物病害防治中研究和应用更为广泛，用来防治植物病害是较好的选择[25]。不同分子量的壳寡糖产生的抑菌作用会有差异，贾盼盼 等[17]发现分子量为3 000 Da的壳寡糖对杏采收后果实病原菌比分子量1 000 Da和5 000 Da的壳寡糖具有更强的抑菌作用。比较两种不同分子量的壳寡糖对花椒干腐病菌F.sambucinum的抑菌活性发现，分子量3 000 Da的壳寡糖的生物活性较强[16]。本试验中，研究壳寡糖对花椒干腐病的主要病原菌F.zanthoxyli的抑菌活性及防病机制，发现分子量为3 000 Da壳寡糖对花椒干腐病具有较好的防控效果。因此，在研发壳寡糖生物农药时，有必要筛选具有不同分子量的壳寡糖原材料。

壳寡糖分子链中存在羟基、氨基和少量N－乙酰氨基以及其他活性基团，对金属具有很好的配位作用。若选取特定分子量的壳寡糖与金属离子络合，制备的壳寡糖金属复合物的抗菌活性功能会明显增强，如壳寡糖－Ag＋纳米粒子能显著地抑制3种疫霉属Phytophtora病原菌的生长和繁殖[26]；壳寡糖铜悬浮剂能有效地防治黄瓜细菌性角斑病[27]。这为深入研发防治花椒干腐病的壳寡糖生物制剂提供了很好的思路。

为了明确壳寡糖对花椒干腐病盆栽苗的防治效果，该研究基于人工接种系统以控制对照和处理的试验条件完全一致。壳寡糖的施用方式为将含有无菌壳寡糖溶液的脱脂棉包裹于接种位点，这种处理方式能增强壳寡糖对花椒干腐病菌的作用强度。若是开展田间试验防治花椒干腐病，由于干腐病发生在花椒的枝干上，常规的药剂喷雾难以有效接触病原菌，可以采用涂抹的施药方式，相比常规的喷雾方式，这有助于药剂更直接有效地接触病原物，作用靶标更精准，更有利于抑制病原物的生长和侵入，从而控制病斑的扩展[28]。使用纯净的壳寡糖更能有效研究壳寡糖在植物病害防治中的构效关系，但是纯品壳寡糖价格昂贵。虽然本研究中使用的壳寡糖为混合物，但是其对花椒干腐病的防治效果显著，且价格低廉，这使田间大规模使用壳寡糖生物制剂防治花椒干腐病成为可能。