云南省石榴干腐病病菌生物学特性研究及其防治药剂筛选

鲁海菊+李河+史淑義

摘要：以石榴干腐病病菌SGF1为供试菌株，采用菌丝生长速率法测定不同培养基、碳源、氮源、温度、酸碱度、光照和湿度对其菌丝生长的影响，用血球计数板计测产孢量，并在室内筛选有效抑菌药剂。结果表明，该病原菌菌丝生长最佳培养条件为PDA培养基、以可溶性淀粉为碳源、蛋白胨为氮源、28 ℃、pH值为7、全光照、相对湿度60%。BA培养基、28 ℃、pH值8最适合产孢。58%甲霜灵·锰锌可湿性粉剂、75%百菌清可湿性粉剂和50%扑海因可湿性粉剂3种药剂抑菌效果最好，抑制率达100%。研究结果为云南石榴干腐病的防治提供了一定的理论依据。

关键词：石榴；干腐病；生物学特性；药剂筛选

中图分类号： S436.65 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2017）01-0099-04

石榴（Punia granatum）是滇南主要水果之一。云南省蒙自市由于北回归线穿境而过，独特的气候条件适宜石榴种植，曾获“中国石榴之乡”的美誉。目前蒙自市石榴栽种面积跃居全国首位，然而随着栽种面积不断扩大，石榴受到各种真菌病害的危害，严重影响其品质和产量。蒙自市石榴干腐病在1979年，戴芳澜先生的《中国真菌总汇》中早有记载[1]。1999年，周又生等研究蒙自市石榴干腐病发生规律及其防治，使蒙自市石榴干腐病得到有效控制[2]。2011年，蒙自市石榴干腐病再次暴发流行。据文献记载蒙自市石榴干腐病由石榴鲜壳孢（Zythia versoniana）引起[1，3]，而陕西省报道的石榴干腐病由石榴垫壳孢菌（Coniella granati）引起[4]。由此可见，不同地区石榴干腐病病菌种属分类地位不同，其生物学特性也会存在差异。周又生等研究蒙自市石榴干腐病病菌生物学特性，仅限于温度、湿度和pH值3个方面[2]，未对其碳源、氮源、光照等方面进行系统研究，防治化学药剂也仅限于百菌清、甲基硫菌灵、代森锌和波尔多液。鉴于此，笔者对蒙自市石榴干腐病病菌生物学特性及其抑菌剂做系统研究，以期为有效防控该病提供系统理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

从云南省蒙自市石榴种植基地采集症状典型的石榴干腐病病果，采用常规组织分离和单孢分离法进行分离纯化，获得的菌株（SGF1）于斜面培养基上低温（4 ℃）保存。

1.2 供试培养基

PDA（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）：马铃薯200 g、葡萄糖16 g、琼脂粉20 g、蒸馏水1 L；PSA（马铃薯蔗糖琼脂培养基）：马铃薯200 g、蔗糖16 g、琼脂粉 20 g、蒸馏水1 L；MA（玉米琼指培养基）：玉米30 g、琼脂粉17 g、蒸馏水1 L；WA（燕麦琼脂培养基）：小麦30 g、琼脂粉20 g、蒸馏水1 L；CA（胡萝卜琼脂培养基）：胡萝卜200 g、琼脂粉20 g、蒸馏水1 L；CM（查氏培养基）：硝酸钠2.00 g、磷酸二氢钾1.00 g、氯化钾0.50 g、七水硫酸镁0.50 g、硫酸铁0.01 g、蔗糖30.00 g、琼脂粉 20 g、蒸馏水1 L；BA（大豆葡萄糖琼脂培养基）：大豆200 g、葡萄糖16 g、琼脂粉20 g、蒸馏水1 L；WJA（万寿菊葡萄糖琼脂培养基）：万寿菊植株200 g、葡萄糖16 g、琼脂粉20 g、蒸馏水1 L。上述培养基配制好后均121 ℃高压灭菌25 min。

1.3 试剂

碳源（可溶性淀粉、α-乳糖、麦芽糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖醇、D-甘露醇）、氮源（硫酸铵、硝酸铵、磷酸二氢铵、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、甘氨酸、尿素）。0.1% HCl、0.1% NaOH溶液，试剂均为分析纯。

1.4 供试杀菌剂

甲霜灵·锰锌、多菌灵、甲基硫菌灵、百菌清、扑海因、春雷霉素。上述材料均购自农贸市场及试剂公司。

1.5 不同培养基对菌丝生长的影响

将石榴干腐病病菌在PDA平板培养基中，28 ℃扩大培养7 d，在培养基同一半径周围用打孔器取直径为5 mm的菌块，同时接种于PDA、PSA、CM、MA、WA、CA、BA和WJA 8种培养基平板中央，设3次重复，在25 ℃下恒温培养7 d，十字交叉法测定菌落直径，用血球计数板计数产孢量[5]。

1.6 不同碳、氮源对菌丝生长的影响

以查氏培养基为基础培养基，分别用相等质量分数的碳源（可溶性淀粉、α-乳糖、麦芽糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖醇、D-甘露醇）和氮源（硫酸铵、硝酸铵、磷酸二氢铵、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、甘氨酸、尿素）替换蔗糖和硝酸钠，设不加碳源、氮源为对照。接种及测量方法同“1.5”节。

1.7 不同温度对菌丝生长的影响

以PDA为供试培养基，接种后分别在10、15、20、25、30、35、40 ℃下恒温培养[5]，接种及测量方法同“1.5”节。

1.8 不同pH值对菌丝生长的影响

以PDA为供试培养基，分别用0.1% HCl及0.1%NaOH溶液将pH值调至3、4、5、6、7、8、9、10[5]，接种及测量方法同“1.5”节。

1.9 光照对菌丝生长的影响

以PDA为供试培养基，接种后分別在光—暗周期为 12 h—12 h、全黑暗和全光照3种光处理下培养[5]，接种及测量方法同“1.5”节。

1.10 不同湿度对菌丝生长的影响

将病菌接种于PDA培养基平板中央，分别在相对湿度为50%、60%、70%、80%、90%、100%的培养箱中培养7 d[5]，测量方法同“1.5”节。

1.11 药敏性测定

将58%甲霜灵·锰锌、50%多菌灵、70%甲基硫菌灵、75%百菌清、50%扑海因、6%春雷霉素6种可湿性粉剂杀菌剂按照使用说明上的浓度配成PDA含药营养液后倒平板，将石榴干腐病病菌菌块接种于平板中央，设不加药液的PDA平板为对照，培养7 d后，测量菌落直径，并计算6种药剂对菌落生长的抑制率[5]，接种及测量方法同上。

抑制率=[（dCK-dB）/dCK]×100%。

式中：dCK表示对照病原菌菌落直径，dB表示处理病原菌菌落直径。

1.12 数据分析

所有试验数据均采用SPSS 19.0统计软件Duncans多重比较法进行统计分析，计算处理间的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对菌丝生长及其产孢的影响

由表1可知，供试菌株SGF1均能在8种不同培养基上生长，具有较强的营养适应性，说明供试菌株对营养条件的要求并不是很严格，但对8种培养基的利用效果有所差异。经Duncans多重比较发现，供试菌株在8种不同培养基上的菌落直径差异极显著，其中，在PDA培养基上生长最快，在CM培养基上生长最慢。在其余6种培养基上的生长强弱顺序为PSA>WJA>WA>CA>BA>MA。另外，在8种培养基中，病菌SGF1产孢量差异极显著，其中，在BA培养基中产孢最多，在CM上不产孢。因此，最适合该病菌菌丝生长的培养基为PDA，最适合产孢的培养基为BA。

2.2 不同碳源对菌丝生长的影响

由表2可知，除在D-甘露醇和无碳源对照中不能生长之外，供试菌株SGF1在其余6种不同碳源培养基上均能生长，经Duncans多重比较发现，麦芽糖和葡萄糖中菌落直径差异不显著，但与其余碳源差异极显著。α-乳糖、鼠李糖和木糖醇3个处理间的菌落直径差异极显著，菌落直径大小顺序为α-乳糖>鼠李糖>木糖醇。可溶性淀粉中菌落直径与其余所有供试碳源差异极显著，且菌落直径最大。说明可溶性淀粉最有利于其菌丝生长。

2.3 不同氮源对菌丝生长的影响

由表3可知，供试菌株SGF1在8种氮源培养基上均能生长。但其对氮源的利用效果不同。经Duncans多重比较发现，蛋白胨中菌落直径与其余氮源差异极显著，且菌落直径最大。其中，硫酸铵、硝酸铵、甘氨酸和尿素中菌落直径小于对照，表明这4种氮源对其有抑制作用。其余4种氮源对供试菌株生长有促进作用，蛋白胨最有利于其菌丝生长。

2.4 不同温度对菌丝生长及产孢的影响

由表4可知，供试菌株SGF1在10～35 ℃范围内均能生长。经Duncans多重比较发现，各温度处理间的菌落直径差异极显著。在10～28 ℃范围内，温度越高菌落直径越大，28 ℃ 时菌落直径达到最大值，30 ℃和35 ℃时菌落直径小于28 ℃时，40 ℃时菌落直径为0.00 mm。另外，28 ℃时产孢量与其余温度差异极显著，且产孢量最大。25 ℃和30 ℃时差异极显著，产孢量均小于28 ℃时。其余温度下产孢量均为0，说明28 ℃是供试菌株菌丝生长及产孢的最佳温度。

2.5 不同pH值对菌丝生长及产孢的影响

由表5可知，供试菌株SGF1在pH值3～10范围内均能生长。经Duncans多重比较发现，pH值为7时与其余处理间菌落直径差异极显著，且菌落直径最大，说明pH值7为菌丝生长最佳酸碱度值。pH值6、pH值8、pH值9，3个处理间菌落直径差异均不显著，pH值3和pH值4这2个处理间菌落直径差异不显著，其余处理间菌落直径差异极显著。pH值8产孢量与其余处理差异极显著，且产孢量最大。因此，中性偏碱环境有利于供试菌株菌丝生长及产孢。

2.6 不同光照对菌丝生长的影响

由表6可知，供试菌株SGF1在3种不同光照条件下均能生长。经Duncans多重比较发现，3种处理间菌落直径差异极显著，且全光照菌落直径最大，光暗交替菌落直径最小，全黑暗居中。说明全光照最有利于其生长。

2.7 不同湿度对菌丝生长的影响

由表7可知，供试菌株SGF1在相对湿度50%～100%范围内均能生长。经Duncans多重比较发现，相对湿度60%与其余处理间菌落直径差异极显著，且菌落直径最大。说明供试菌株最适合的湿度为60%。超出此范围，病菌的生长受到抑制。

2.8 石榴干腐病菌药敏性试验

由表8、图1可知，6种药剂对供试菌株SGF1的抑制作用不同。经Duncans多重比较发现，在58%甲霜灵·锰锌可湿性粉剂、75%百菌清可湿性粉剂和50%扑海因可湿性粉剂的培养基中菌落直径差异不显著，但与其余处理间差异极显著，病菌均不能生长，抑制率达到100%。50%多菌灵可湿性粉剂、70%甲基硫菌灵可湿性粉剂和6%春雷霉素3种药剂之间菌落直径差异极显著，抑制率在25%～55%之间。说明抑菌效果最好的药剂为58%甲霜灵·锰锌可湿性粉剂、75%百菌清可湿性粉剂和50%扑海因可湿性粉剂。

3 结论与讨论

对石榴干腐病病菌SGF1菌株生物学特性的研究表明，最适培养基为PDA培养基、最佳碳源为可溶性淀粉、氮源为蛋白胨、最适温度为28 ℃、最佳酸碱度为pH值7、全光照、最适相对湿度为60%。其对温度和pH值的要求与周又生等[2]、宁豫婷等[6]、孙德茂[7]的研究结果一致。湿度的研究结果与孙德茂的结论[7]不一致，原因是蒙自市和陕西省2地石榴干腐病病菌種属分类地位不同。石榴干腐病属于世界性病害，中国山西[8]、山东[9]、陕西[4]、河南[10]、安徽[11]、贵州[12]、云南[2]等省份均有报道。其中，河南[6，10，13]、贵州[11]、云南[2]的石榴干腐病病菌为石榴鲜壳孢，陕西省报道的石榴干腐病病菌为石榴垫壳孢菌[4]。希腊[14]和韩国[15]的石榴干腐病病菌与中国陕西省的一致。中国其他省份的石榴干腐病病菌尚未见系统鉴定，对其生物学特性也未见系统研究报道。笔者研究发现，光照对病菌生长有影响，可溶性淀粉为最佳碳源，蛋白胨为最佳氮源，硫酸铵、硝酸铵、甘氨酸和尿素4种氮源对其病菌有抑制作用，磷酸二氢铵对其病菌生长有促进作用。因此，在石榴上施用氮肥可选择硫酸铵、硝酸铵、甘氨酸和尿素，避免施用磷酸二氢铵。

另外，在室内药剂筛选方面，甲霜灵·锰锌、百菌清和扑海因3种药剂对SGF1菌株抑制效果最好，抑制率均达100%，其他3种药剂抑菌效果不理想，抑制率均小于60%。这与孙德茂[7]、汤玉等[10]、周又生等[2]、孙国山[16]的研究结果不尽相同。百菌清防治效果好，这一结论与周又生等的研究结论[2]一致，多菌灵防效与左振琴等的研究结果[13]不一致。说明不同地区使用的有效药剂不尽相同。有必要对当地发生的石榴干腐病进行药剂筛选。蒙自地区石榴干腐病可选用甲霜灵·锰锌、百菌清和扑海因防治。

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