聚焦“PCR技术” 突破一轮复习重难点

陈颉

摘 要 在以科研實际应用为背景的高考命题中，PCR技术相关知识点的考查也层出不穷。PCR技术的操作与应用是学生普遍反映的基因工程考题的难点之一。高三一轮复习具有承上启下的特点。在高三一轮复习中，针对PCR技术，教师可通过微视频讲解、数形结合、节选例题、引导学生小组讨论等手段，夯实基本概念，探讨条件优化，拓展应用类型，层层递进，突破教学重难点。

关键词 高中生物 一轮复习 PCR

自20世纪80年代多聚酶链式反应（PCR）与热稳定型DNA聚合酶（Taq酶）被发现以来，DNA扩增技术有了突破性的进展，PCR技术在现代基因工程操作中的应用也越来越广。在以科研实际应用为背景的高考命题中，PCR技术相关知识点的考查也层出不穷。学生普遍反映基因工程考题的难点之一为PCR技术的操作与应用。因此，笔者在一轮复习中就如何突破PCR技术的教学重难点作了以下的尝试。

一、PCR技术的知识点架构

高三一轮复习具有承上启下的特点。在复习中教师既要帮助学生对所学知识进行提炼，又要注重学生在学科核心素养方面的提升。基于维果斯基的最近发展区理论，笔者把高中生物有可能涉及的PCR技术知识点做了如图1所示的架构设计。在这个知识点架构中，“基本概念”和“条件优化”两部分间是递进关系，都是重要的基础性知识。只有深刻理解和掌握这两部分内容，才能完成“应用类型”这一学生难于理解和运用部分的学习。而“应用类型”的知识点之间也是递进关系。笔者通过适当选取与之相关的高考试题，依据这种递进关系把一道试题拆解成梯度难度的多个问题，帮助学生突破这一难点。

二、PCR技术重难点的突破

在突破PCR技术重难点的教学实践中，笔者是通过适当采用微视频讲解、数形结合、节选例题、引导学生小组讨论等教学手段来达成的。

（一）夯实PCR技术基本概念

PCR的全称、原理、原料、基本过程等，都是已经学习过的知识性内容，在课堂教学过程中，教师可采取由学生依据学案进行回顾作答即可。

由于教材对PCR反应的基本过程描述非常简单，图示为静态图示，导致部分学生理解困难。在视频网站上有很多动态模拟视频，笔者挑选了一段约80秒的微视频，在课堂上连续播放两次。笔者在第一次播放视频的过程中，边播放边补充讲解;在第二次播放视频前，提醒学生注意其与细胞内DNA复制的区别，再让学生自行观看体会;之后引导学生分组讨论，结合对细胞内DNA复制过程相关知识的回顾，完成比较与总结（见表1）。

有些学生会认为两者所需的原料和能量不同：PCR反应的原料是dNTP，细胞内DNA复制的原料（按教材必修模块所述）是游离的脱氧核苷酸，并且需要ATP供能。实际上，在这两个过程中，dNTP既可作为原料，又起到供能的作用，而ATP可为细胞中的DNA解旋过程供能[1]。

（二）探讨PCR技术条件优化

在PCR反应中，温度和时间的控制要求如下：①解旋温度与加入Taq酶的时间会影响扩增的特异性;②退火温度会影响产物的特异性，也会影响引物与模板的配对;③延伸温度取决于Taq酶的活性，延伸时间与产物的特异性及产量有关[2]。其中，与高中生物知识具有关联性的是退火温度的选择及原因。笔者选取2017年江苏高考与之相关的部分试题为例（详见例1）。

例1 PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏___▲___的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但___▲___的引物需要设定更高的退火温度。

参考答案：引物与模板;GC含量高。

在PCR反应中引物的设计要求如下：①引物自身及引物之间不应存在互补序列;②引物长度及GC含量合适，以保证合适的Tm值（一定条件下的寡核苷酸解链温度）;③引物在模板序列中的特异性;④引物3′端的碱基选择等[3]。其中，除了已经讨论过的GC含量的影响外，如何避免引物互补及引物的特异性这部分内容与高中生物知识联系较大。笔者选取2011年江苏高考与之相关的部分试题为例（详见例2）。

例2 设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（见图2），请分别说明理由。

① 1组：___ ▲___;  ②第2组：___▲___。

参考答案：引物Ⅰ与引物Ⅱ局部互补配对而失效;引物Ⅰ′自身折叠后互补配对而失效。

（三）拓展PCR技术应用类型

PCR技术的应用非常广泛，本课教学设计选取了与高中生物课程相关度比较高的六个类型。

1.仅扩增。“仅扩增”指已经获得了目的基因全长序列，使用PCR技术扩增该序列的操作。笔者对2017年江苏高考题的一幅图片做了修改（见图3）。该图体现了模板单链之间、模板单链与引物之间、模板单链与新合成单链之间的反向平行关系。笔者要求学生根据该图解答：以1个DNA分子为模板，进行n次PCR循环，①至少需要多少个引物？（2n+1-2）②形成的DNA分子中含多少个引物1？（2n-1）③含引物1的单链有多少条？（2n-1）④含引物1的DNA分子有多少个？（2n-1）以上思考有助于学生理解“仅扩增”PCR的过程，以及解答后续例题。

2.扩增且截取。“扩增且截取”指目的基因位于模板DNA分子中间位置，从模板DNA中截取目的基因并扩增的操作。笔者展示图3的原图（图4），要求学生比较两图的异同。

该过程的数量结果大部分与“仅扩增”相同，笔者引导学生对该图继续进行解答：①第几轮产物中首次出现两端等长的目的基因片段？（3）②第3轮产物中两端等长的目的基因片段占所有产物的比例是多少？（1/4）③第n轮产物中两端等长的目的基因片段的数量有多少？（2n-2n）通过比较图3和图4，学生能够更准确地掌握PCR的两种最基本的应用类型，为更好地理解后续其他应用类型打好基础。

3.擴增且延长。“扩增且延长”指在引物的5′端增加若干碱基，获得比模板DNA更长的产物分子的操作。笔者选取2014年南通二模与之相关的部分试题为例（详见例3）。

例3 如图5，①过程从野生酵母菌染色体DNA中PCR扩增介导序列时，科研人员设计了如下一对引物：GAATTCGACCTCAAATCAGGTAGG和TTGCATTGACTTACACCTAGG，其中下划线部分序列的设计依据是___▲___，方框部分序列的设计目的是___▲___。

参考答案：介导序列两端的部分DNA序列;使扩增出的介导序列两端含限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列。

笔者引导学生思考为什么把碱基添加在引物的5′端，提示学生联系DNA的化学结构及DNA聚合酶的功能特点等知识。并适当补充通过设计引物来延长扩增产物长度的相关应用，如在目的基因前连接启动子、连接两段目的基因片段、添加保护序列等。

4.定点诱变。“定点诱变”指在引物中改变个别碱基，造成扩增产物发生基因突变的操作。笔者以2019年南通二模题为例（详见例4）。

例4 如图6，通过设计引物，运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变。下图为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5′端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。有关叙述正确的是（多选）          。

A.引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因定向插入

B.在PCR反应体系中还需要加入4种游离核苷酸、解旋酶、Taq酶等

C.第3轮PCR，引物1能与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因

D.第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/2

参考答案：AC。

在该题所述的操作中，通过引物的设计，将模板DNA分子中的G//C碱基对，替换为扩增产物分子中的A//T碱基对。该题设置的选项恰好覆盖了本课已复习内容，可起到随堂检测、学情反馈的作用。

在讲解该题之后，笔者进一步追问：采用题述定点诱变方法，只能诱变目的基因两端的位点，如果需要在目的基因靠中间的位置进行定点诱变，又该如何操作？由此引出重叠延伸PCR技术（图7），该技术亦可用于扩增长片段DNA和融合基因构建[4]。

5.定量分析。“定量分析”指在PCR反应体系中加入标记物，从而测算PCR产物或模板的量的操作。常用的标记物为荧光标记，通过PCR进行定量的方法称为qPCR。近年又发展出了实时荧光定量PCR，称为RT-qPCR。实时荧光定量PCR的标记方法又分为非特异性标记法和特异性标记法，其中前者比较容易理解。笔者从网络上搜索到了一段约100秒的视频进行播放，帮助学生初步理解qPCR。而对于后者，笔者选取2017年南通二模与之相关的部分试题为例（详见例5）。

例5 如图8～9，实时荧光定量PCR（qPCR）实现了PCR从定性到定量的飞跃。TaqMan探针是qPCR技术中一种常用探针（如图8），其5′末端连接荧光基团（R），3′末端连接淬灭剂（Q）。当探针完整时，R发出的荧光信号被Q吸收而不发荧光。在qPCR扩增过程中，当Taq酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R和Q，R发出的荧光信号被相应仪器检测到，荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步（如图9）。请回答下列问题：

（1）与质粒相比，TaqMan探针中除荧光基团、淬灭剂外，特有的化学成分是___▲___。

（2）根据TaqMan探针功能分析，探针中碱基序列的设计应主要依据___▲___，同时要避免与___▲___发生碱基互补配对。

（3）若每分子探针水解释放的R基因荧光强度为a，加入的目的基因为b个，请根据图示过程，使用数学公式表示反应体系中荧光信号强度（Rn）与扩增次数（n）之间的关系：___▲___。

参考答案：（1）核糖和尿嘧啶;（2）目的基因内部部分核苷酸序列、引物;（3）Rn=ab×（2n-1）。

例5涉及到遗传物质的化学组成、PCR技术的操作要点、荧光定量PCR的数量关系等。其中第（3）小题对学生的综合能力要求较高。为了帮助部分解题有困难的学生，笔者把问题拆解成以下4个：①每个模板分子的双链都能与探针配对吗？（只有一条单链与探针配对）②游离出的R基团数与新合成的单链数的关系？（是新合成单链数的一半，相当于每合成一个新的分子，会游离出一个R基团，即2n - 1）③以1个目的基因为模板，总的荧光强度为何值？④以b个目的基因为模板，总的荧光强度为何值？以上问题的设置，降低了思维跨度，帮助学生不断达到自己的“最近发展区”。

6.反转录PCR。“反转录PCR”指以RNA为模板进行的PCR操作，可以联合定量分析，也可以不定量。其应用的场景有：①检测目的基因的表达量（mRNA的量）;②检测RNA病毒的含量;③直接由mRNA获得大量cDNA。其中场景①可与基因工程的检测与鉴定联系，场景②可与多种RNA病毒（新型冠状病毒、禽流感病毒等）的检测联系，场景③可与构建cDNA文库联系。以上场景均来自学生已经学习的重要知识点或感触颇深的社会热点，有助于进一步提升学生的学科核心素养。反转录PCR与常规PCR相比，除了初始模板分子不同外，还需要多加入一种特殊的酶——热稳定型反转录酶，两者的原料、过程、数量关系等，在目前高中生物知识范畴内均类似，本文不再展开。

三、教学反思

在本课的教学实践中，笔者通过对试题的遴选、删减、加工和重新编排，有的放矢地对相关知识点精讲精练，帮助学生层层递进地理解与掌握PCR技术，成功地突破了这一重难点，取得了较好的教学效果。近年来，基因工程及PCR技术的发展日新月异，有限的教学设计中无法囊括PCR技术的所有应用类型，特别是相对高中生而言比较复杂的巢式PCR、多重PCR等。但是相信经过这样的训练，学生在将来的学习、科研生涯中若遇到PCR技术在其他方面的应用，也能很快触类旁通。

[参 考 文 献]

[1]刘学廷.高中生对DNA复制过程的几个认识误区[J].中学生物教学，2016（1/2）：80-81.

[2]叶倩.PCR技术综述[J].科技创新导报，2009（5）：5.

[3]尤超，赵大球，梁乘榜，等.PCR引物设计方法综述[J].现代农业科技，2011（17）：48-51.

[4]李守宇.重叠延伸PCR技术及其在生物学中的应用[J].生物学教学，2013，38（4）：65-66.

（责任编辑：赵晓梅）