一种基于咔唑衍生物的用于检测细胞微环境pH的酸响应荧光探针

余羿 何秀全

1 山东大学晶体材料研究所 （山东 济南 250100）

2 山东大学基础医学院 （山东 济南 250012）

内容提要： 荧光探针在细胞环境检测中发挥着独特的作用，而细胞中微环境pH值的变化已成为潜在疾病的重要标志。在这项工作中，我们设计了基于典型的咔唑单元的探针TSS。在选择性实验中，TSS在若干种生物分析物中显示出对pH的极高选择性。随体外pH值变化，发射峰的强度与峰位也会发生显著变化。此外，MTT分析的结果表明，TSS对细胞毒性低，因此该探针在活体系统中具有成像能力。用NH4Cl处理细胞后发现，与未处理的细胞相比，荧光仅在绿色通道中的荧光强度呈现显著降低。由此可见，TSS这一独特的性能使其有可能应用于疾病诊断和相关医学领域。

细胞内pH是细胞质中的游离生物分子和离子[1]共同决定的一项重要生理参数，它蕴含着诸多细胞内活动的相关信息。正常细胞的pH值往往维持动态稳定，而癌症细胞由于代谢活跃，因此更容易产生异常并导致细胞内pH出现波动，针对这一现象进行癌症诊断具有一定的潜力[2]。

在各种检测pH值变化的方法中，场效应晶体管、碳纳米点等均可实现对pH值变化的检测[3,4]。其中部分尽管精度较高，却无法应用于细胞等微环境中。近年来，荧光法因其操作简便、无创而成为细胞pH变化检测的一种良好解决方案。

根据可感应的pH范围，检测pH变化的荧光探针可大致可分为两类[5]。一类用于细胞中性区，其pH范围约为6.80～7.40，如细胞质；另一类用于细胞中pH范围位于约4.50～6.00内的酸性微区，如溶酶体等细胞器。用于检测pH变化的荧光探针应具有高选择性，高灵敏度和良好的光稳定性。某些商业pH探针，如OregonGreen和BCECF，由于pH响应范围较窄，发射波长单一，导致其检测部位有限。因此，具有较宽pH响应范围和发射峰可变的荧光探针可能是解决上述问题的合理思路。

咔唑及其衍生物是荧光探针中最为常见的一种碱性荧光团。在以前的研究中，基于咔唑设计的荧光探针实现了对细胞凋亡等生理活动的检测[6]。在本工作中，我们开发了一种基于咔唑的酸响应pH荧光探针，并成功将该探针应用于检测细胞微环境的pH变化。

1.实验部分

1.1 实验仪器

紫外可见吸收光谱：日立U2910紫外光谱仪；荧光光谱：日立F 2700荧光分光光度计。核磁氢/碳谱：布鲁克AVANCE 400核磁共振仪；高分辨率质谱：安捷伦技术6510 Q-TOF LC/MS质谱仪；共聚焦荧光成像：奥林巴斯FV-1200共聚焦显微镜。

1.2 实验试剂

用于选择性实验的金属盐与氨基酸购自上海萨恩，合成中使用的药品、光谱实验溶剂购自北京国药，柱层析和薄层色谱使用的硅胶粉与硅胶板购自青岛海洋化学。所有药品均为分析纯，所有光谱测试溶剂均为色谱纯。PBS缓冲溶液参数：10mmol NaCl，Na2HPO4·12H2O，NaH2PO4·2H2O，pH=7.40。

1.3 探针的制备

探针TSS的合成路线如图1所示。

其中，TSS合成步骤如下：

化合物1、2按照文献[7]报道的方法合成。先用10mL DMF溶解化合物2（0.12g，0.4mmol）、乙酸钯（0.004g，0.02mmol）、三邻甲苯基膦（0.016g，0.06mmol），并一同添加到50mL单颈烧瓶中，搅拌半小时，再加入4-乙烯基吡啶（0.213mL，2mmol），并在氮气鼓泡下继续搅拌半小时。烧瓶放置在95°C油浴锅中，并在氮气保护下搅拌回流至少36h。得到的溶液经过萃取、干燥和柱层析提纯，最终得到55mg淡黄色粉末（48%）。

1H NMR（400MHz，DMSO-d6）：δH（ppm）10.07（s，1H），8.77（s，1H），8.58（d，J=6.0Hz，2H），8.33（d，J=8.0Hz，1H），8.00～8.02（m，2H），7.74～7.82（m，2H），7.60～7.65（m，3H），7.44～7.49（m，H），4.57（q，J=6.8Hz，2H），1.40（t，J=7.2Hz，2H）

13C NMR（100MHz，DMSO-d6）：δC（ppm）192.36，150.58，144.48，144.28，141.28，135.49，134.25，128.97，127.42，126.47，124.65，123.22，122.65，121.70，121.29，120.18，110.22，108.88，14.32。

高分辨质谱（HRMS）（ESI）m/z：C22H18N2O（[M+H]+）计算值：327.3990；实测值：327.1497。

1.4 光物理性质测试

所有实验中使用的均为添加了20%DMSO的PBS缓冲溶液。加入测试溶液的探针等量等浓度（20μL/5μM），溶剂为DMSO。

滴定实验方法：将探针分别添加到11组pH范围3.0～8.0（每组pH间隔0.5）的10mL缓冲溶液中。

选择性实验方法：将探针分别添加到含有对应分析物（5mM）的10mL缓冲溶液中，溶解分析物前缓冲液pH分别为5.0与7.4。实验时记录荧光光谱中较高发射峰对应的波长与强度。

图1.探针TSS的合成路线

光稳定性实验方法：将探针分别添加到pH分别为5.0与7.4的10mL缓冲溶液中，实验时，各组溶液在405nm激光光源下保持照射25min，并且每5min测试一次荧光光谱，并记录较高的发射峰对应的波长与强度。

可重复性实验方法：将探针添加到缓冲溶液中，pH初始值为5.0，获得荧光光谱后，添加1mM的NaOH溶液使其pH为7.4，立刻取样检测，同样地，使用1mM的HCl溶液调节回pH为5.0，并立刻取样检测。以上步骤反复5次。

以上实验中，紫外-可见吸收光谱记录范围为250～800nm，荧光光谱记录范围为420～800nm，其中激发波长均为405nm，使用的狭缝为激发狭缝5.0nm，发射狭缝10.0nm

1.5 细胞培养与荧光成像

A549（人肺腺癌）细胞购自湖南丰晖生物。将A549细胞接种在DMEM培养基中，并在37°C，5% CO2恒温箱中培养，培养时添加10%胎牛血清和1%抗生素（青霉素和链霉素）。细胞第二天贴壁后再进行成像。成像前，需用PBS先漂洗3次，再与浓度为5μM的探针在37°C下孵育30min。

细胞内pH变化响应实验方法：实验组：按照以上步骤孵育后，先拍摄一组正常情况获得的细胞图像，然后向培养基中加入NH4Cl溶液，使NH4Cl最终浓度达到10mM后，再孵育4h，并进行成像。对照组：先拍摄一组正常情况获得的细胞图像，然后向培养基中加入不含NH4Cl的等量蒸馏水（不影响细胞活动），孵育4h后进行成像。

2.结果与讨论

2.1 探针光谱实验

为了研究探针TSS的pH传感特性，我们检测了不同pH时紫外-可见吸收光谱与荧光光谱（图2）。在弱碱性-中性环境（pH 6.0～8.0）中，吸收峰位于325nm，当pH值逐渐减小至酸性范围（3.0～4.0）时，380nm处出现吸收峰，且强度呈增加趋势。对于发射光谱，在405nm激发下产生双发射峰，波长差65nm且随pH降低，556nm处的发射峰强度显着增大，而491nm处的另一发射峰强度显著降低。以上现象表明，TSS有可能在细胞中多个pH范围内发射荧光，并可在不同波长范围内接收到荧光信号。

图2.探针TSS（5μM）在不同pH下对各种生物分析物（5mM）的选择性实验。分析物名称表示在横轴。

图3.探针TSS（5μM）对pH响应的紫外-可见光谱（A）与荧光光谱（B）

2.2 探针选择性实验

由于醛基可能与氨基酸反应（如醛基与半胱氨酸结合形成噻唑烷[8]），探针结构的吡啶单元可能与细胞质中的游离离子结合，因此，我们测试了探针与若干种氨基酸、常见阳离子，常见阴离子和几种氧化物的选择性。测试结果表明不同pH值下这些物质均未对荧光发射强度产生明显干扰。证明了TSS对pH具有良好选择性。

2.3 探针稳定性/可重复性实验

根据前文所述的实验步骤，我们测试了探针的光稳定性和可重复性。一方面，在不同pH下，探针的荧光强度均能在25min内逐渐稳定，强度维持在90%以上；另一方面，在循环测试中，探针可实现荧光强度几乎完全的恢复（＞90%）。以上结果进一步验证了探针的可靠性。

2.4 探针传感机制研究

为了解探针的氢离子的传感机制，我们利用Gaussian 09[9]进行了DFT计算（图4，使用B3LYP/6-31G(d) level进行空间结构优化）。由于TSS具有典型D-π-A结构，因此在图中可见电子向吡啶单元的迁移。通过计算，得出TSS+H+与TSS的HOMO-LUMO能隙分别为2.17eV和3.79eV，解释了吸收光谱中双发射峰的55nm红移的产生。

图4.TSS和TSS+H+的化学、DFT优化结构与HOMO和LUMO轨道图，图中标记了各轨道对应的能量情况。

2.5 活细胞内荧光成像

首先，为了确认探针毒性，我们对不同浓度（0，1，5，10，15，20μM）的TSS进行了MTT测试，所有组细胞存活率均超过85%，体现了TSS的低毒性与生物相容性。

为了验证TSS在细胞中的成像能力与pH响应能力，我们利用A549细胞进行了激光共聚焦荧光显微成像实验（图5）。对于正常培养的细胞，我们观察到A549细胞可在蓝、绿通道中接收到荧光（图5A）。用氯化铵溶液处理细胞，使其pH上升后[10]，我们可以观察到绿色通道（530～600nm）荧光强度发生了更为显着的变化；而蓝色通道（420～490nm）荧光强度变化不明显（图5B）。

图5.A549细胞中探针TSS（5μM）的共聚焦荧光图像。（A）用NH4Cl（aq）处理前的图像；（B）用NH4Cl（aq）处理后的图像。（C）NH4Cl（aq）处理前后不同采集通道中圆形区域1和2对应的荧光强度。图中蓝色通道范围：420～490nm；绿色通道范围：530～600nm。激发波长：405nm。比例尺：20μm。

为了进一步区分变化情况，我们采集了两组图像不同圆形区域处理前后的荧光强度（图5C）。结果表明，蓝色通道的荧光强度平均变化了约5%。而绿色通道强度则平均降低了约60%。这一趋势与体外实验结果一致。以上实验结果证明：TSS对体内pH变化敏感，并且具有监测细胞微环境pH变化的潜力。

3.小结

总之，我们报道了一种具有低生物毒性，并且可实现细胞内pH变化的响应和发射峰移动的荧光探针TSS。在光物理实验中，该探针对酸性区间具有很高的选择性。另外，通过对不同pH下A549细胞的生物成像，证明了该探针对体内pH检测具有潜在实用价值。我们认为，TSS以及基于咔唑及其衍生物的探针将在未来更加深入地研究，并使相关领域的更多研究人员受益。