基于p63MAPK探究抵当汤对急性出血性脑卒中大鼠凋亡相关基因Bax/Bcl-2/Caspase3表达的影响

肖瑶 任吉祥 冯丽娜 兰天野 黎明全

(长春中医药大学 1中西医结合学院，吉林 长春 130117；2附属医院；3中医学院)

脑卒中是急性脑循环障碍致局灶性或弥漫性脑功能缺损。根据不同病理性质可分缺血性及出血性两大类，出血性脑卒中主要包括脑出血(ICH)和蛛网膜下腔出血。脑卒中是仅次于恶性肿瘤之后第二城乡居民死亡的病因，ICH是第二大脑卒中类型，约占所有脑卒中的15%，世界范围内ICH发病率约为25%，亚洲为50%。出血性脑卒中因其起病急、病情重、致死率高、致残明显、严重威胁着人类健康，给患者带来沉重的家庭经济负担及心理负担，尤其对老年人更为凶险〔1〕。目前，大部分患者会接受外科手术治疗，老年患者多接受内科治疗，如控制血压、降低颅内压、减轻水肿等。因老年患者依从性较差，病程长，药物安全性较差，往往临床效果不尽如人意〔2〕。传统医学认为“脑卒中”是指一切中于风邪突然而来的疾病，在金元以后,对于脑卒中多认为是因“内风”而引起〔3〕。现代中医学者多认为出血性脑卒中的病机是肝肾阴虚、肝阳失敛、阳热化风携痰火上犯脑脉，导致出血性脑卒中〔4〕。已故国医大师任继学教授为我国当代极富盛名的中医学者，在中医脑病尤其急症方面具有卓越贡献。任教授提出用“破血逐瘀法”治疗出血性脑卒中，临床疗效显著。而抵当汤为破血逐瘀法的代表方剂，出自《伤寒论》，原治疗下焦蓄血，具有活血化瘀、泻下通腑之功效〔5〕。本实验选取破血逐瘀法代表方剂抵当汤治疗急性ICH模型大鼠，为其治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1实验药物 抵当汤组成：水蛭、虻虫、桃仁、大黄，购于长春中医药大学附属医院药剂科。按传统工艺制备水煎剂，水煎液在减压条件下浓缩至1 g/ml，4℃条件下保存。全煎煮过程由长春中医药大学药物中医药研究中心负责。

1.2造模及分组 90只清洁级Wistar大鼠(半雌半雄)，6周龄，体重180～220 g，购于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。适应性饲养1 w，自由饮食。模型构建：根据文献资料，复制大鼠ICH模型〔6,7〕，模型组、抵当汤低、中、高剂量组大鼠腹腔注射垂体后叶注射液2 U/kg，1次/d。2 w后，用改良Nath法复制ICH模型。10%水合氯醛腹腔麻醉后，仰卧固定于鼠板，右侧腹股沟区备皮并消毒。分离并暴露出股动脉，在远心端处结扎，用肝素冲洗过的微量进样器抽取股动脉血50 μl后结扎并缝合。脑立体定位仪上大鼠俯卧位固定好后，头部备皮并消毒，沿中线切开并暴露前囟。根据脑立体定位图谱〔8〕进行右侧尾状核定位后缓慢注血50 μl并留针5 min，缝合头皮，涂抹青霉素粉以防止术后感染。假手术组按上述方法操作，但不注入自体血。以Longa评分法〔9〕进行评价：0分：无神经系统功能缺损；1分：左前侧肢体不能充分伸展；2分:行走时，出现转圈；3分：行走时，出现向患侧倾斜；4分：无法独立行走，失去意识。2～3分的大鼠为造模成功，纳入实验。造模成功后(除假手术组18只)将其余72只SD大鼠随机分为:模型组、抵当汤低、中、高剂量组，每组18只。

1.3干预及标本采集 按照抵当汤低剂量组：0.13 g/100 g体重；抵当汤中剂量组：0.26 g/100 g体重；抵当汤高剂量组：0.52 g/100 g体重，汤药灌胃，1次/d。假手术组及模型组按1 mg/100 g体重，生理盐水灌胃，1次/d。抵当汤各剂量组、假手术组及模型组分别灌胃1 d、3 d、7 d后，处死各组所有大鼠，分离海马，取患侧大脑皮层。

1.4研究内容 ①大鼠神经功能评分：采用Garcia评分法〔10〕进行评价；②大鼠脑组织切片苏木素-伊红(HE)染色：取治疗3 d后的各组大鼠断头，沿针孔/冠状位切取厚为3 mm脑组织后在固定液中保存,在生理盐水中充分漂洗,在10%甲醛中固定24 h,梯度酒精脱水，并制作病理组织切片,HE染色。光学显微镜下观察脑组织病变及神经元修复。③蛋白样品的制备及重复性检验：取PMSF+RIPA裂解液与脑组织碎片混匀，低温匀浆、冰上裂解后，离心，提取上清液同时弃沉淀，收集细胞，并将上清分装于0.5 ml离心管，-80℃保存。重复性检验：相对标准差统计学方法评估蛋白定量重复性是否符合生物重复统计学一致性。④差异蛋白界定及注释与差异表达蛋白功能富集分析：以1.2倍为差异表达变化阈值，以统计学t检验确定在各比较组中蛋白上调和下调个数；并从基因本论(简称GO)、KEGG通路进行了详细的蛋白注释，并对差异蛋白的功能进行GO二级注释分类，根据差异表达蛋白，进一步进行GO分类，以发现差异表达蛋白在某些功能类型具有显著性富集趋势。⑤RT-PCR 定量技术检测脑组织B淋巴细胞瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)3 mRNA的表达水平：取灌胃3 d后各组大鼠脑组织，提取总RNA，并测定RNA的纯度和含量以备后续实验。用cDNA第一链合成试剂盒合成cDNA。以GAPDH为内参，用2-ΔΔCt方法分析相关基因的表达水平。引物：Bcl-2正向序列：GGTCCCGAAGTAGGAAAGGA，反向序列：GGTCCCGAAGTAGGAAAGGA；Bax正向序列：GGTCCCGAAGTAGGAAAGGA，反向序列：GGTCCCGAAGTAGGAAAGGA；Caspase3正向序列：CGGAGCTTGGAACGCGA，反向序列：ACACAAGCCCATTTCAGGGTA；GADPH正向序列：ACCACAGTCCATGCCATCAC，反向序列：TCCACCACCCTGTTGCTGTA。

1.5统计学方法 采用SPSS23.0软件进行主差分析、t检验。

2 结 果

2.1各组神经功能缺损评分比较 假手术组无神经功能缺损表现，而模型组有偏瘫、追尾征等行为学改变。灌胃1 d、3 d、7 d抵当汤高剂量组神经功能缺损评分明显高于模型组，且7 d>3 d>1 d神经功能缺损评分，1 d、3 d抵当汤高剂量组神经功能缺损评分明显高于抵当汤低剂量组(P<0.05)，3 d、7 d抵当汤中剂量组神经功能缺损评分明显高于模型组，且7 d>3 d神经功能缺损评分(均P<0.05)；7 d抵当汤低剂量组神经功能缺损评分明显高于模型组(P<0.05)。见表1。

表1 各组灌胃不同时间神经功能缺损评分比较分，n=18)

2.2各组脑组织病理学观察 假手术组神经细胞排列较规整，细胞大小一致。模型组可见出血灶，伴炎细胞浸润，周围可见坏死的神经细胞和弥漫性增生的胶质细胞，且神经细胞排列散乱、细胞间隙增大，神经细胞胞体收缩。抵当汤低、中、高剂量组也可见出血灶，周围伴神经细胞坏死及炎症反应，但周边大部分神经细胞结构尚完整，与模型组比较，抵当汤低、中、高剂量组出血有所减少，神经细胞排列间隙减小，整体细胞排列较为整齐。见图1。

图1 各组脑组织病理学观察(HE，×400)

2.3重复性检验 采用相对标准差统计学方法，评估蛋白定量重复性符合生物重复统计学一致性。见图2。

A～I：1 d假手术组、1 d抵当汤高剂量组、1 d模型组、3 d假手术组、3 d抵当汤高剂量组、3 d模型组、7 d模型组、7抵当汤高剂量组、7 d模型组图2 重复样本间蛋白定量相对标准偏差分布箱线图

2.4不同比较组差异蛋白功能富集分析 1 d抵当汤高剂量组/1 d模型组中刺激应答差异蛋白个数为22个(11%)；在1 d模型组/1 d假手术组中刺激应答差异蛋白个数为112个(10%)；在3 d抵当汤高剂量组/3 d模型组中刺激应答差异蛋白个数为27个(8%)；在3 d模型组/3 d假手术组中刺激应答差异蛋白个数为51个(10%)，见图3。其中1 d模型组/1 d假手术组刺激应答蛋白p63 MAPK上调1.286倍(P<0.05)，1 d治疗高剂量组/1 d模型组中p63MAPK下调0.708倍(P<0.05)；3 d模型组/3 d假手术组p63MAPK上调1.357倍(P<0.05)；3 d抵当汤高剂量组/3 d模型组p63MAPK下调0.642倍(P<0.05)。见图3。

A～D：3 d抵当汤高剂量组/3 d模型组、3 d模型组/3 d假手术组、1 d抵当汤高剂量组/1 d模型组、1 d模型组/1 d假手术组图3 各比较组GO二级注释BP(生物过程)差异蛋白分布

2.5各组脑组织Bcl-2、Bax、Caspase3 mRNA表达水平比较 与假手术组比较，模型组Bcl-2 mRNA表达量明显降低(P<0.05)；各治疗组与模型组比较，Bcl-2 mRNA表达量均明显升高(均P<0.05)，其中以抵当汤高剂量组表达升高最为明显。与假手术组比较，模型组Bax、Caspase3 mRNA表达量均明显升高(P<0.05，P<0.01)；各治疗组与模型组比较Bax、Caspase3 mRNA表达量均明显降低(P<0.05，P<0.01)，以高剂量组表达降低最为明显。见表2。

表2 各组脑组织Bcl-2、Bax和Caspase3 mRNA表达水平比较

3 讨 论

急性ICH是主要的非创伤性脑损伤，并划分为原发性脑损伤和继发性脑损伤。ICH起病急、病程短，患者常突然出现眩晕、呕吐、头痛、意识障碍等〔11〕。西医学对急性ICH常采用外科手术治疗，对待老年人则采取内科保守治疗，但临床效果不甚理想〔2〕。因此对于治疗此种疾病，探寻安全性较高的药物日趋急迫。

祖国医学对急性ICH的认识历史悠远，《内经》中最早将脑卒中记载 “偏枯”“偏风”等，汉代张仲景首次提出“中风”病名〔12〕，金代刘完素首提 “中风先兆”，并提出“中风者，有先兆之征，凡人觉大拇指及次指麻木不仁，或手足不用，或肌肉蠕动者，3年内必有大风至”。认为脑卒中的发病机制为气血阴阳失调，痰湿内盛于内，肝阳上亢，阳动化热，肝风携痰上犯脑脉，破血妄行发病〔13〕。研究认为热、痰、瘀三者既是病因亦为病理产物，伺机发病。故提出用“破血化瘀、泻热醒神、化痰开窍”的方法治疗出血性脑卒中〔14,15〕。抵当汤为“破血化瘀”之代表方剂，首见于《伤寒论》，由大黄、桃仁、水蛭、虻虫四味药组成，其临床治疗效果显著，但机制仍不明确。

p63MAPK蛋白为MAPK蛋白家族中p53一员，于1998年被发现，大量研究表明p63介导的信号转导途径在细胞增殖、凋亡、分化和黏附迁移方面有调控作用〔16～18〕。p63可形成寡聚体，结合DNA，反激活p53响应基因并介导细胞周期停滞，细胞衰老和细胞凋亡(响应DNA损伤)〔19〕。同时p53能通过激活促凋亡因子，同时抑制抗凋亡因子以使线粒体通透并参与凋亡程序〔20,21〕。p63由于存在启动子和选择性剪切的不同，可产生两大类蛋白异构体：一类由P1启动子启动转录，生成具有反式激活、氨基酸全长的TAp63,其功能类似于p53，显示出明确的促凋亡活性，能够调节p53下游靶基因的表达，阻滞细胞周期并诱导凋亡。另一类由P2启动子启动转录，生成氨基酸截短的△Np63，可通过竞争DNA结合位点的方式拮抗p53或TAp63，具有促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的作用〔22〕。作为转录因子，p63可影响MAPK级联反应途径及PI3K-AKT通路介导细胞生长与增殖相关蛋白的合成、抗凋亡等细胞事件〔23,24〕。p63能结合靶基因的p53样应答元件，调节多种转录因子，生长因子受体，由于其下游基因具有多种细胞生物学功能，因此处于这个调控网络的关键节点显得十分重要。凋亡是对于组织稳态和免疫必不可少的程序性细胞死亡途径。其中Bcl-2家族和Caspase家族是参与细胞凋亡调控的重要基因。Bax及Bcl-2同属于Bcl-2家族，Bax基因参与促凋亡，而Bcl-2参与抑制凋亡〔25〕。Bcl-2蛋白家族能通过促进线粒体外膜通透性(MOMP)控制并调节线粒体的凋亡途径。MOMP使凋亡因子从线粒体释放到胞质中，进一步激活Caspase级联反应〔26,27〕。Caspase3被称为死亡蛋白执行酶，参与细胞凋亡的执行。Caspase3作为Caspase家族中多种凋亡途径的共同下游,在细胞凋亡过程中起重要作用。Caspase3的激活主要依赖Cyt-c的释放,而Bcl-2和Bax可通过线粒体途径介导Cyt-c等物质释放，从而激活Caspase3〔28〕。活化后的Caspase3酶解切割DNA依赖的蛋白激酶和聚腺苷二磷酸核糖多聚酶(PARP)等,进而影响DNA复制、转录和损伤修复〔29〕。Bcl-2家族和Caspase家族在细胞凋亡途径，尤其是线粒体途径的调控起重要作用。

综上，急性ICH大鼠模型应用抵当汤后，症状有所改善，且高剂量效果最好。且抵当汤能下调p63MAPK蛋白及介导MAPK信号通路，并通过调控Bax、Bcl-2及Caspase3凋亡相关基因表达，从而达到治疗急性ICH的效果。