沉默LncRNA SLCO4A1-AS1通过靶向miR-876-3p抑制宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭

王洪伟 林娟 (海南医学院第二附属医院妇产科，海南 海口 570311)

宫颈癌是女性第二大常见恶性肿瘤，更是导致女性癌症相关死亡的主要原因〔1，2〕。目前，随着手术、放化疗等诊疗手段的不断进展，宫颈癌的诊疗取得一定效果，但由于肿瘤的转移和复发，宫颈癌患者的长期生存率仍不理想。因此，迫切需要探索宫颈癌发生和转移的分子机制。长链非编码RNA(LncRNA)是一类长度超过200个核苷酸非编码RNA，没有或仅有有限的蛋白编码潜能〔3〕。研究表明，LncRNA通过调控肿瘤细胞增殖、侵袭和存活从而发挥癌基因或抑癌基因作用〔4〕。溶质载体有机阴离子转运蛋白家族成员4A1反义RNA1(SLCO4A1-AS1)是近年发现的一个LncRNA，其在结肠癌中发挥致癌基因作用，敲减SLCO4A1-AS1在体外可抑制结肠癌细胞的增殖、迁移、侵袭及上皮间质转化，促进细胞凋亡，在体内抑制肿瘤的生长〔5〕。但目前并无SLCO4A1-AS1和宫颈癌的相关报道。miR-876-3p是一种抑癌基因，研究发现miR-876-3p在胰腺癌中表达下调，过表达miR-876-3p可抑制胰腺癌细胞的增殖和转移〔6〕。生物信息学分析显示，miR-876-3p是SLCO4A1-AS1的潜在靶基因，但SLCO4A1-AS1能否调控miR-876-3p表达进而影响宫颈癌的生物学行为尚未可知。因此，本研究旨在探讨SLCO4A1-AS1对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响，并初步探讨其可能分子机制。

1 材料与方法

1.1实验材料 宫颈癌细胞(SiHa、HeLa、C33a、Caski)和正常的永生化宫颈上皮细胞系Ect1/E6E7均购自美国ATCC；RPMI1640培养基和胎牛血清均购自美国Gibco公司；LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司；si-con、si-SLCO4A1-AS1、miR-con、miR-876-3p mimics、anti-miR-con、anti-miR-876-3p、pcDNA、pcDNA-SLCO4A1-AS1、WT-SLCO4A1-AS1、MUT-SLCO4A1-AS1的构建测序及聚合酶链反应(PCR)引物均购自上海生工公司；逆转录试剂盒和SYBR Green PCR试剂盒均购自大连TaKaRa生物技术有限公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)试剂盒购自美国APExBIO公司；Transwell小室和基质胶均购自美国Corning公司产品；TRIzol试剂、放射免疫沉淀试验(RIPA)裂解液、Western洗涤液、Western封闭液、硝酸纤维素(NC)膜、辣根过氧化酶(HRP)标记山羊抗兔的Ⅱ抗均购自中国碧云天公司；兔源细胞周期素(Cyclin)D1抗体、兔源P21抗体、兔源基质金属蛋白酶(MMP)-2抗体、兔源MMP-9抗体、兔源GAPDH抗体均购自美国Abcam公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养和分组 采用RPMI1640培养基分别培养宫颈癌细胞和正常宫颈细胞，培养基中均添加10%的胎牛血清，在37℃，含5%CO2的细胞培养箱中进行细胞培养。实验分组：本实验选取HeLa细胞进行后续研究，将HeLa细胞随机分为NC组(正常培养的HeLa细胞)、si-con组(转染si-con)、si-SLCO4A1-AS1组(转染si-SLCO4A1-AS1)、miR-con组(转染miR-con)、miR-876-3p组(转染miR-876-3p mimics)、si-SLCO4A1-AS1+anti-miR-con组(共转染si-SLCO4A1-AS1和anti-miR-con)和si-SLCO4A1-AS1+ anti-miR-876-3p组(共转染si-SLCO4A1-AS1和anti-miR-876-3p)。转染方法严格按照LipofectamineTM2000使用说明书进行。

1.2.2qRT-PCR检测 采用TRIzol试剂分别提取4种宫颈癌细胞和正常宫颈细胞Ect1/E6E7的总RNA，逆转录试剂盒将RNA逆转为cDNA，以cDNA为扩增模板进行qRT-PCR扩增。分别以U6和β-actin为内参，2-ΔΔCt法计算miR-876-3和SLCO4A1-AS1的相对表达水平。

1.2.3双荧光素酶报告基因检测 采用生物信息软件starbase在线预测SLCO4A1-AS1的靶基因，发现SLCO4A1-AS1和miR-876-3存在部分连续互补的核苷酸序列。随后对二者的靶向关系进行验证。构建野生型WT-SLCO4A1-AS1和突变型MUT-SLCO4A1-AS1的SLCO4A1-AS1-3′UTR荧光素酶报告基因载体，分别将WT-SLCO4A1-AS1和突变型MUT-SLCO4A1-AS1与miR-876-3 mimics或miR-con共转染至HeLa细胞，转染48 h，采用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性。

1.2.4MTT法检测细胞活力 采用MTT法检测细胞活力，将HeLa细胞按照2×103个/孔(200 μl)接种到96孔板，进行相应转染后，分别于转染24 h、48 h、72 h时向每孔内添加20 μl的MTT溶液(5 mg/ml)，继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 μl的DMSO，摇床震荡10 min，使结晶物充分溶解。选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值。

1.2.5Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力 侵袭实验：转染48 h时消化细胞，离心弃去细胞培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2次，采用不含血清的RPMI1640重悬细胞，调整细胞密度约为1×106个/ml。取200 μl细胞悬液加入铺有基质胶的Transwell上室内，向下室加入500 μl含10%血清的RPMI1640培养液，常规培养24 h后，用棉签擦去基质胶和上室内的细胞，用甲醇固定下室膜30 min，0.1%结晶紫染色20 min，用33%醋酸脱色后，倒置于显微镜下随机选择3个视野，记录细胞总数，拍照，取其均值即为侵袭细胞数。迁移实验采用未铺有基质胶的小室，其他步骤同侵袭实验。

1.2.6Western印迹检测 使用RIPA裂解液各组细胞，收集蛋白样品，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。配制十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)液，按照1∶1比例将蛋白样品与蛋白上样缓冲液(2×)混合，沸水浴加热3～5 min，以充分变性蛋白。冷却到室温后，直接上样到SDS-PAGE胶加样孔。停止电泳后，用标准湿式转膜装置将蛋白转移至硝酸纤维素(NC)膜，转膜完毕后，立即用Western洗涤液洗膜2 min，滴管吸尽洗涤液，加入Western封闭液室温摇床封闭1 h，吸尽封闭液后，立即加入稀释好的Ⅰ抗室温摇床孵育1 h，Western洗涤液洗膜3次(5 min/次)，加入相应的已稀释二抗室温摇床孵育1 h，再次用Western洗涤液洗膜后，加入电化学发光(ECL)显色试剂在暗室内显色，Image J分析目的条带灰度值。

1.3统计学方法 采用SPSS20.0软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1宫颈癌细胞系中SLCO4A1-AS1和miR-876-3p的表达 与Ect1/E6E7组相比，其余各组SLCO4A1-AS1表达水平均显著升高，miR-876-3p表达水平均显著降低(均P<0.05)。选取SLCO4A1-AS1表达水平升高和miR-876-3p表达水平降低最明显的HeLa细胞进行后续研究。见表1。

表1 宫颈癌细胞系中SLCO4A1-AS1和miR-876-3p的表达

2.2沉默SLCO4A1-AS1对宫颈癌细胞HeLa增殖的影响 与NC组和si-con组比较，si-SLCO4A1-AS1组HeLa细胞SLCO4A1-AS1的表达水平显著下降(P<0.05)，表明沉默SLCO4A1-AS1的宫颈癌细胞株构建成功。与NC组和si-con组比较，si-SLCO4A1-AS1组HeLa细胞p21蛋白表达水平显著升高，CyclinD1蛋白表达水平显著降低，细胞增殖活力显著降低(均P<0.05)，见图1、表2。提示沉默SLCO4A1-AS1抑制宫颈癌细胞的增殖能力。

图1 检测宫颈癌细胞HeLa中p21和CyclinD1蛋白的表达

组别SLCO4A1-AS1细胞活力(OD490 nm)24 h48 h72 hp21CyclinD1NC组1.00±0.110.36±0.040.65±0.081.12±0.110.57±0.070.79±0.08si-con组0.97±0.090.35±0.050.63±0.071.08±0.090.61±0.050.81±0.09si-SLCO4A1-AS1组0.23±0.311)2)0.28±0.031)2)0.45±0.051)2)0.87±0.071)2)0.83±0.091)2)0.36±0.051)2)F值P值44.1640.00010.2600.00123.7390.00019.3980.00034.1420.000102.6530.000

2.3沉默SLCO4A1-AS1对宫颈癌细胞HeLa迁移和侵袭的影响 与NC组和si-con组比较，si-SLCO4A1-AS1组HeLa细胞MMP-2和MMP-9蛋白的表达均显著降低，迁移和侵袭细胞数目均显著较少(P<0.05)。见图2、表3。提示沉默SLCO4A1-AS1抑制宫颈癌细胞的侵袭和迁移能力。

图2 宫颈癌细胞HeLa迁移和侵袭及转移相关蛋白的表达(结晶紫染色，×200)

组别迁移细胞数目(个)侵袭细胞数目(个)MMP-2MMP-9NC组176.37±15.2185.73±9.480.83±0.090.64±0.05si-con组172.86±12.3891.33±9.560.88±0.080.69±0.07si-SLCO4A1-AS1组75.46±8.461)2)25.28±4.561)2)0.46±0.051)2)0.31±0.041)2)F值194.153179.24083.594127.900P值0.0000.0000.0000.000

2.4SLCO4A1-AS1靶向调控miR-876-3p的表达 生物信息学分析发现，SLCO4A1-AS1和miR-876-3p存在部分连续特异性互补的核苷酸序列，见图3。miR-876-3p组SLCO4A1-AS1-WT水平显著低于miR-con组(P<0.001),见表4。si-con组HeLa细胞miR-876-3p的表达水平(1.00±0.09)显著低于si-SLCO4A1-AS1组(4.36±0.44，P<0.05)；pcDNA组HeLa细胞miR-876-3p的表达水平(0.96±0.08)显著高于pcDNA-SLC04A1-AS1组(0.53±0.05，P<0.05)。提示miR-876-3p是SLCO4A1-AS1的靶基因，SLCO4A1-AS1能够靶向负调控miR-876-3p的表达。

图3 SLCO4A1-AS1与miR-876-3p互补的核苷酸序列

表4 双荧光素酶报告实验

2.5过表达miR-876-3p对宫颈癌细胞HeLa增殖、迁移、侵袭的影响 与NC组和miR-con组比较，miR-876-3p组HeLa细胞miR-876-3p的表达水平显著升高(P<0.05)，表明过表达miR-876-3p的宫颈癌细胞株构建成功。与NC组和miR-con组比较，miR-876-3p组HeLa细胞p21蛋白的表达水平显著升高，CyclinD1、MMP-9、MMP-2蛋白的表达水平显著下降，细胞增殖活力显著降低，迁移和侵袭数目显著减少(均P<0.05)，见图4、表5。提示过表达miR-876-3p抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

图4 过表达miR-876-3p对宫颈癌细胞HeLa中p21、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表达的影响

组别CyclinD1MMP-9MMP-2迁移细胞数目(个)侵袭细胞数目(个)NC组0.84±0.080.92±0.090.84±0.08180.92±15.5781.64±7.84miR-con组0.81±0.080.94±0.070.78±0.09176.84±15.6778.68±8.52miR-876-3p组0.42±0.041)2)0.51±0.061)2)0.47±0.051)2)72.63±7.681)2)32.35±4.761)2)F值102.93895.80162.629185.964131.650P值0.0000.0000.0000.0000.000

2.6抑制miR-876-3p部分逆转沉默SLCO4A1-AS1对宫颈癌细胞HeLa增殖、迁移、侵袭的作用 与si-con组比较，si-SLCO4A1-AS1组HeLa细胞miR-876-3p和p21表达显著升高，CyclinD1、MMP-9、MMP-2蛋白表达水平显著下降，细胞增殖活力显著降低，迁移和侵袭数目显著减少(均P<0.05)；与si-SLCO4A1-AS1+anti-miR-con组比较，si-SLCO4A1-AS1+anti-miR-876-3p组HeLa细胞miR-876-3p和p21表达显著降低，CyclinD1、MMP-9、MMP-2蛋白表达水平显著升高，细胞增殖活力显著升高，迁移和侵袭数目显著增加(P<0.05)，见图5、表6。提示抑制miR-876-3p表达部分逆转沉默SLCO4A1-AS1对宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响。

1～4：si-con组、si-SLCO4A1-AS1组、si-SLCO4A1-AS1+anti-miR-con组、si-SLCO4A1-AS1+ anti-miR-876-3p组图5 抑制miR-876-3p对宫颈癌细胞HeLa中p21、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表达的影响

3 讨 论

宫颈癌是全球最严重的女性恶性肿瘤之一，转移性宫颈癌患者的生存率较低〔3〕。研究表明，LncRNA在宫颈癌中发挥细胞调节因子作用，参与宫颈癌的发生发展〔7〕。

SLCO4A1-AS1定位于人类20q13.33位点，是一种新型的LncRNA。研究显示，SLCO4A1-AS1在恶性肿瘤的进展中发挥关键作用。Wang等〔8〕研究发现，SLCO4A1-AS1在结肠癌组织和细胞中表达上调，SLCO4A1-AS1通过调控miR-508-3p/分离缺陷基因(PARD)3轴诱导保护性自噬促进结肠癌细胞增殖；Yang等〔9〕指出在膀胱癌组织中SLCO4A1-AS1也呈高表达，SLCO4A1-AS1的表达水平与膀胱癌晚期和转移呈正相关，SLCO4A1-AS1表达上调提示膀胱癌患者预后不良，沉默SLCO4A1-AS1可抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，抑制肿瘤在体内的生长；此外，Yang等〔6〕研究表明，SLCO4A1-AS1还可通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进结肠癌肿瘤的生长和转移。本研究结果表明，SLCO4A1-AS1在宫颈癌中可能发挥致癌基因作用。

许多研究报道LncRNA可阻断miRNA在肿瘤进展中的功能，恢复靶基因的表达，参与宫颈癌的发生发展。Shao等〔10〕研究发现，LncRNA STXBP5-AS1通过靶向miR-96-5p/PTEN轴抑制宫颈癌细胞的增殖和迁移能力；Jin等〔11〕认为，LncRNA小核仁RNA宿主基因(SNHG)12可抑制miR-125b活性，促进信号转导和转录活化因子(STAT)3在宫颈癌细胞中的表达，进而促进肿瘤的形成。然而SLCO4A1-AS1能否通过类似的机制调控宫颈癌的发生发展尚不清楚。生物信息学分析显示，SLCO4A1-AS1可能在宫颈癌中与miR-876-3p直接相互作用。miR-876-3p位于人9号染色体p21.1位点，研究显示，miR-876-3p在人胶质母细胞瘤中表达下调，可能与胶质母细胞瘤的耐药有关〔12〕；在胃癌细胞中miR-876-3p呈低表达，其表达下调与胃癌患者不良预后呈负相关，过表达miR-876-3p靶向p24跨膜转运蛋白(TMED)3可增加胃癌顺铂耐药细胞的药物敏感性〔13〕。本研究结果表明，SLCO4A1-AS1可能直接靶向miR-876-3p参与宫颈癌的发生发展。

本研究结果提示，SLCO4A1-AS1通过靶向miR-876-3p促进宫颈癌的恶性进展。已有的研究表明，STAT3在宫颈癌中显著上调，抑制STAT3进而抑制宫颈癌细胞的侵袭和转移〔14，15〕。环状RNA-0006988通过调控miR-876-3p/STAT3促进胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭〔16〕。在后续研究中，我们将进一步探究SLCO4A1-AS1调控miR-876-3p/STAT3通路在宫颈癌进展中的作用。

综上，SLCO4A1-AS1在宫颈癌细胞中表达上调，miR-876-3p表达下调。沉默SLCO4A1-AS1通过靶向miR-876-3p抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭。SLCO4A1-AS1有望成为一种新型的宫颈癌治疗靶点。