间歇运动调控miR-155/SIRT1/FoxO3a通路抑制心梗大鼠肾脏细胞凋亡

林琴琴，王湘怡，耿元文，李若明，田振军

组蛋白去乙酰化酶Sirtuin1（SⅠRT1），NAD+依赖性去乙酰化酶，属于ⅠⅠⅠ类组蛋白/蛋白质去乙酰酶，是沉默信息调节者2（silent information regulator 2，Sir2）家族成员之一[1]。SⅠRT1在细胞凋亡、衰老和代谢等多种细胞过程中发挥关键作用[2]。新近研究证实SⅠRT1是肾脏疾病治疗的新靶点[3]，SⅠRT1激活可抑制肾脏细胞凋亡，减缓糖尿病肾病、造影剂或脂多糖导致的急性肾损伤（Acute kidney injury，AKⅠ）[4-6]。研究[7-8]证实SⅠRT1介导下游靶标包括叉头框转录因子O3a（Forkhead box O3a，FoxO3a），其促进细胞存活、细胞凋亡和炎症等。体内外实验[9]结果均证实SⅠRT1激活显著降低2型糖尿病小鼠肾脏皮质及高糖诱导人肾小球内皮细胞中FoxO3a表达，降低肾脏细胞凋亡，减缓糖尿病肾病的发生。SⅠRT1沉默可显著增加HK-2细胞中高糖诱发的氧化应激及FoxO3a过表达[10]，因此SⅠRT1/FoxO通路可能成为预防和治疗肾脏损伤的潜在靶标。文献[11]表明运动对肾脏损伤保护具有良好效果。有氧运动可显著降低急性缺血肾损伤大鼠肾脏肾小管损伤程度，抑制细胞凋亡，提升肾脏功能。研究[12-13]发现有氧运动可显著提高心肌梗死（myocardial infarction，MⅠ）大鼠心肌或衰老大鼠骨骼肌中SⅠRT1表达，抑制细胞凋亡。间歇运动较有氧运动更有效保护肾脏功能[14-15]。但间歇运动是否激活MⅠ大鼠肾脏SⅠRT1/FoxO通路，抑制肾脏细胞凋亡，保护肾脏功能，目前尚无文献报道。

微小RNA（MicroRNAs，miRs）是长度约22个核苷酸的内源性非编码RNA，通过对靶mRNA的3'非翻译区的互补序列退火，促进其降解或抑制翻译过程[16]，进而调控细胞增殖分化、凋亡和免疫反应等多种生物学进程[17-19]。此外，它们还通过靶向相关基因作为缺血性肾病发展和进程的预后标志物[20-21]。研究[22]证实miR-155上调表达在缺血再灌注（ischemia/reperfusion，Ⅰ/R）诱导AKⅠ大鼠肾脏和缺氧复氧损伤（hypoxia-reoxygenation injury，HRⅠ）大鼠肾小管导管上皮细胞中，且其过表达促进细胞凋亡并抑制细胞增殖，而抑制miR-155表达发挥相反作用。最新研究[23]证实抑制Ⅰ/R小鼠心肌miR-155高水平表达，靶向上调SⅠRT1表达，进而抑制心肌细胞凋亡，减少梗塞面积，促进心功能。有氧运动可显著降低乳腺癌或冠心病患者血清miR-155表达[24-25]。但间歇运动是否通过miR-155/SⅠRT1通路参与MⅠ后肾脏细胞凋亡的调节，尚未见文献报道，因此，本研究拟探讨间歇运动对MⅠ大鼠肾脏miR-155及其下游通路SⅠRT1/FoxO3a表达和肾脏细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 动物分组与MI模型制备

36只3月龄雄性SD大鼠，初始体重为180～220 g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供（动物质量合格证号：陕医动证字SCXK2012-098），分笼饲养，自由饮食水，室温20～29℃，湿度50%～60%。适应性喂养1周后，随机分为假手术组（Sham组）、心肌梗死组（MⅠ组）和心梗+间歇有氧运动组（ME组），每组12只。各心梗组采用左冠状动脉前降支（LAD）结扎造模。术前腹腔注射5%戊巴比妥钠麻醉，开胸暴露心脏，结扎LAD，观察结扎远端心肌颜色变浅或变白，心电图S-T段抬高或T波倒置，即为MⅠ模型造模成功，后逐层缝合关胸。为排除手术因素干扰，Sham组手术过程同上，但仅穿线不结扎LAD。

1.2 间歇有氧运动方案

ME组大鼠在术后1周开始训练，运动方案参考WⅠSLOFF等的训练模型[26]。适应性训练1周（10～15 m/min，30 min/天，共5天）。正式训练起始速度10 min×10 m/min（40%～50%·VO2max）热身，以7 min×25 m/min（85%～90%VO2max）和3 min×15 m/min（50%～60%VO2max）交替进行大中等强度间歇运动。总时间为60 min，每周训练5天，连续训练4周。上述运动方案无大鼠死亡。

1.3 Western blot

肾脏组织匀浆后，RⅠPA提取总蛋白，BCA试剂盒定量。取40μg蛋白经10%～12%SDS-PAGE分离后，转至PVDF膜，3%BSA室温封闭后，加入一抗Bax（Abcam，1：5 000）、FoxO3a（Abcam，1：5 000）、caspase-3（Abcam，1：1 000）、SⅠRT1（Abcam，1：1 000）、Bcl-2（Affinity，1：1 000）、cleaved-caspase-3（Affinity，1：1 000）和GAPDH（1：8 000），4℃过夜，复温后，加入二抗（1：10 000）孵育1 h，充分洗涤后，ECL发光成像。利用Bio-Rad多色凝胶成像系统图像分析软件Ⅰmage Lab Software 5.2进行分析处理。

1.4 RT-qPCR

肾脏组织匀浆后，TRⅠzol（Ⅰnventragtion）提取总RNA，反转录合成cDNA后，进行PCR扩增。引物序列 如 下 ：SⅠRT1上 游 引 物 ：5'-CAGTTCCAGCCATCTCTGTG-3'，下 游 引 物 ：5'-GCAACCTGCTCCAAGG TATC-3'；GAPDH上游引物：5'-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3'，下游引物：5'-TTTGAGGGTGCAGCG AACTT-3'。样品重复3次检测。利用2-△△Ct相对定量法计算SⅠRT1相对表达量，用内参GAPDH对其进行标准化。

TRⅠzol提取肾脏和血清总RNA，按microRNA反转录试剂（TAKARA）说明合成cDNA，以此cDNA为模板进行PCR反应。引物序列如下：miR-155上游引物 ：5'-TTAATGCTAATTGTGATAGGGGF-3'，下 游 引物：mRQ3'Primer。每个样品重复3次检测。运用2-△△Ct相对定量法计算miR-155的相对表达量，用内参U6对其进行标准化。

1.5 数据采集与统计学处理

所有数据均采用SPSS 17.0统计软件进行处理，数据结果以均数±标准差表示。采用单因素方差分析（One-way Analysis of Variance，ANOVA）进行统计学分析，多重比较使用LSD检验。P＜0.05表示显著性差异，P＜0.01表示极显著性差异。

2 研究结果

2.1 心电图记录结果

结果显示Sham组心电图各波段规则正常；MⅠ后心电图S-T段抬高或T波倒置，判定造模成功；ME组心电图趋于正常，表明间歇运动对大鼠MⅠ模型是安全有效的（见图1）。

图1 各组大鼠心电图变化Figure1 The Changes of ECG in Each Group of Rats

2.2 肾脏及血液miR-155表达结果

RT-qPCR结果显示与Sham组比较，MⅠ组肾脏和血液mi R-155表达均显著增加（分别为P＜0.05，P＜0.01）。与MⅠ组比较，ME组肾脏及血液miR-155表达均显著减少（P＜0.01）（见图2）。

图2 各组大鼠肾脏及血液miR-155表达变化Figure 2 The Changes of miR-155 Expression in Kidney and Blood of Rats

2.3 肾脏SIRT1表达结果

RT-qPCR和Western blot结果显示与Sham组比较，MⅠ组肾脏SⅠRT1 mRNA和蛋白表达均显著减少（P＜0.01）。与MⅠ组比较，ME组肾脏SⅠRT1 mRNA和蛋白表达均显著增加（P＜0.01）（见图3）。

图3 各组大鼠肾脏SIRT1 mRNA和蛋白表达变化Figure3 The Changes of SIRT1 mRNA and Protein Expression in Kidney of Rats

2.4 肾脏FoxO3a表达结果

Western blot结果显示与Sham组比较，MⅠ组肾脏FoxO3a蛋白表达明显增多（P＜0.01）。与MⅠ组比较，ME组肾脏FoxO3a蛋白表达显著减少（P＜0.01）（见图4）。

图4 各组大鼠肾脏FoxO3a表达变化Figure4 The Changes of FoxO3a Expression in the Kidney of Rats

2.5 肾脏Bax、Bcl-2和Caspase-3表达结果

Western blot结果显示与Sham组比较，MⅠ组肾脏Bcl-2表达显著减少（P＜0.01），Bax表达显著增加（P＜0.01），Bcl-2/Bax比值显著降低（P＜0.01），Caspase-3和cleaved-Caspase-3表达显著增加（P＜0.01）。与MⅠ组比较，ME组肾脏Bcl-2表达显著增加（P＜0.01），Bax表达显著减少（P＜0.01），Bcl-2/Bax比值显著升高（P＜0.01），Caspase-3和cleaved-Caspase-3表达显著减少（P＜0.01）（见图5）。

2.6 肾脏miR-155表达与SIRT1、FoxO3a、细胞凋亡变化的相关性

相关性分析结果显示肾脏SⅠRT1蛋白表达与FoxO3a、cleaved-caspase-3和Bax蛋白表达呈显著负相关（r=-0.972，P＜0.01；r=-0.967，P＜0.01；r=-0.966，P＜0.01），与Bcl-2蛋白表达呈显著正相关（r=0.880，P＜0.01），表明随着肾脏SⅠRT1表达的增加，MⅠ大鼠肾脏细胞凋亡减少。MⅠ及MⅠ间歇运动后，肾脏miR-155表达与SⅠRT1蛋白表达呈显著负相关（r=-0.889，P＜0.01），与FoxO3a、cleaved-caspase-3和Bax蛋白表达呈显著正相关（r=0.802，P＜0.01；r=0.768，P＜0.05；r=0.772，P＜0.05），与Bcl-2蛋白表达呈显著负相关（r=-0.994，P＜0.01），表明大鼠肾脏miR-155表达与肾脏细胞凋亡密切关系。

图5 各组大鼠肾脏Bax、Bcl-2和caspase-3表达变化Figure 5 The Changes of Bax，Bcl-2 and caspase-3 Expression in the Kidney of Rats

3 分析与讨论

临床研究[27]发现AKⅠ在ST段抬高心梗患者中发生率高达55%，是患者并发心源性休克的独立死亡因素之一。大量研究[28-30]证实细胞凋亡在心梗导致AKⅠ的发病机制中发挥重要作用。S.PASTORⅠ等[30]研究证实了急性心衰伴AKⅠ患者肾脏细胞凋亡程序的初始激活过程，结果发现与急性心力衰竭患者和健康人群相比，急性心衰伴AKⅠ患者肾脏肾小管上皮细胞磷脂酰丝氨酸易位至细胞膜外部，DNA片段化，caspase-8、caspase-9和caspase-3激活；更为重要的是，研究发现急性心衰伴AKⅠ患者肾脏双重凋亡途径激活，通过相同执行途径导致caspase-3激活，诱发细胞凋亡进程。结果表明肾脏细胞凋亡在心梗导致AKⅠ的机制中起重要作用，且其可能是潜在治疗靶点。本研究结果显示MⅠ大鼠肾脏Bcl-2表达减少，Bax表达增加，Bcl-2/Bax比值降低，caspase-3和cleaved-caspase-3蛋白表达增多。表明MⅠ诱发肾脏细胞凋亡进程。众所周知有氧运动具有抗凋亡作用[31-33]。持续有氧运动可显著抑制高脂膳食大鼠心肌细胞凋亡[31]，阻止肥胖大鼠生殖细胞凋亡[32]，减少肾脏Ⅰ/R大鼠肾脏细胞凋亡[33]。另研究证实间歇运动可显著减少高脂膳食小鼠海马神经细胞凋亡，减缓小鼠认知功能障碍[34]；抑制MⅠ大鼠腓肠肌细胞凋亡，逆转MⅠ引起的骨骼肌萎缩[35]。新近研究发现与持续有氧运动相比，间歇运动更显著抑制MⅠ大鼠心肌细胞凋亡[36]和肺动脉高压大鼠右心室细胞凋亡[37]。提示间歇运动具有显著抗凋亡作用，且优于持续有氧运动干预效果。P.S.TUCKER等[14-15]研究发现与持续有氧运动相比，间歇运动更显著减少早期慢性肾脏病大鼠血管紧张素原和炎症因子mRNA表达，提高肾脏重量，增加肾脏特异内源性抗氧化酶活性相关基因mRNA的表达。说明间歇运动较持续有氧运动更有效发挥肾脏保护作用。本实验结果显示间歇运动可显著抑制MⅠ大鼠肾脏Bax蛋白表达，增加Bcl-2蛋白表达，升高Bcl-2/Bax比值，降低caspase-3和cleaved-caspase-3蛋白表达，表明间歇运动显著抑制心梗肾脏细胞凋亡，发挥肾脏保护作用。但其机制如何?

研究证实SⅠRT1激活在应激条件下保护心脏和肾功能[38-39]，而其缺乏与心血管和肾脏疾病的病理生理变化密切相关[40-41]。大量研究表明SⅠRT1具有重要的抗凋亡作用。本研究结果显示MⅠ大鼠肾脏SⅠRT1 mRNA和蛋白表达显著降低。提示SⅠRT1表达降低增加MⅠ肾脏细胞凋亡，加速肾脏损伤相关疾病进程。体内外研究[41]进一步证实链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠肾脏和高糖诱导人肾小管上皮细胞中SⅠRT1表达降低，细胞凋亡增多。结果表明肾脏损伤促进SⅠRT1的失活可能是细胞凋亡进程的环节之一。提示激活SⅠRT1，降低细胞凋亡，提升肾功能。研究[41]证实SⅠRT1激活可显著抑制糖尿病大鼠肾脏和高糖诱导人肾小管上皮细胞中cleaved caspase-3的表达，抑制肾脏细胞凋亡，提升细胞活性和肾脏组织功能。本研究结果显示间歇运动后MⅠ大鼠肾脏SⅠRT1 mRNA和蛋白表达显著增加，caspase-3和cleaved-caspase-3蛋白表达显著降低，提示间歇运动激活SⅠRT1，降低MⅠ肾脏细胞凋亡，提升肾功能。众所周知FoxO是SⅠRT1介导的下游靶标[42]，在许多细胞过程中发挥重要作用，包括增殖，分化和凋亡。研究[43]证实，SⅠRT1抑制FoxO3a表达，诱导细胞死亡。锰增强大鼠嗜铬细胞瘤细胞和小鼠脑组织中SⅠRT1蛋白降解并下调其基因表达，增加FoxO3a表达，剂量依赖性诱导细胞凋亡[44]。本研究结果显示MⅠ导致大鼠肾脏SⅠRT1表达降低，FoxO3a表达增加，细胞凋亡增多。表明SⅠRT1/FoxO3a通路是调控细胞凋亡的重要通路。研究证实SⅠRT1激活或过表达可显著减弱锰诱导嗜铬细胞瘤细胞[9]、2型糖尿病小鼠肾脏皮质及高糖诱导人肾小球内皮细胞[1]和过氧化氢诱导人来源内皮祖细胞[45]中FoxO3a表达，抑制细胞凋亡。本研究结果显示间歇运动可显著增加MⅠ大鼠肾脏SⅠRT1表达，降低FoxO3a表达，且肾脏SⅠRT1蛋白表达与FoxO3a、cleaved-caspase-3和Bax蛋白表达呈显著负相关，与Bcl-2蛋白表达呈显著正相关。结果说明间歇运动可激活MⅠ大鼠肾脏SⅠRT1/FoxO3a通路，抑制肾脏细胞凋亡。

近来研究[19]证实miRs已成为许多生物进程的调节者。mi Rs的过度表达是各种疾病中的常见现象，且其异常表达参与缺血性肾病等特定疾病的发病机理[46]。miR-122上调表达在肾脏Ⅰ/R模型及肾小管上皮细胞中，诱发细胞凋亡，损伤肾功能；抑制miR-122表达可抑制细胞凋亡，减缓Ⅰ/R损伤[47]。另研究[22，48]证实肾Ⅰ/R大鼠肾组织及HRⅠHK2和NRK-52E细胞中，miR-155的表达水平明显上调，且其上调表达促进HRⅠHK2和NRK-52E细胞的细胞凋亡，而抑制miR-155表达，减少肾脏细胞凋亡，缓解肾脏损伤。本研究结果显示，MⅠ大鼠肾脏和血液miR-155表达显著增多，肾脏细胞凋亡增多；间歇运动显著减少MⅠ大鼠肾脏和血液miR-155表达，降低肾脏细胞凋亡。说明间歇运动调节MⅠ肾脏miR-155表达，抑制肾脏细胞凋亡。另研究证实SⅠRT1是miR-155下游靶向蛋白，miR-155靶向抑制SⅠRT1表达，调节T细胞分化，增加炎症反应，扩大疼痛[49]；调节肾脏细胞自噬，扩大糖尿病肾脏损伤[50]。最新研究发现miR-155靶向抑制SⅠRT1表达，增加心肌细胞凋亡数量，扩大梗死面积，减弱心脏功能；而抑制miR-155表达，SⅠRT1表达增加，梗塞面积减少，心肌细胞凋亡数量降低，心脏功能得到提升[23]。本研究结果显示MⅠ大鼠肾脏miR-155表达增多，SⅠRT1表达减少，肾脏细胞凋亡数量增加。间歇运动大鼠肾脏miR-155表达减少，SⅠRT1表达增多，肾脏细胞凋亡降低，且肾脏mi R-155表达与SⅠRT1蛋白表达呈显著负相关，与FoxO3a、cleaved-caspase-3和Bax蛋白表达呈显著正相关，与Bcl-2蛋白表达呈显著负相关。提示间歇运动可能通过抑制心梗大鼠肾脏miR-155表达，激活其下游信号通路SⅠRT1/FoxO3a。推测间歇运动抑制MⅠ大鼠肾脏细胞凋亡，发挥肾脏保护效应，其机制与miR-155/SⅠRT1/FoxO3a通路激活密切相关。

4 结论

间歇运动可显著抑制心梗大鼠肾脏miR-155表达，增加SⅠRT1，降低FoxO3a、cleaved-caspase-3和Bax的表达，增加Bcl-2的表达，抑制肾脏细胞凋亡。推测MⅠ肾脏功能改善和肾脏mi R-155表达降低及下游信号通路SⅠRT1/FoxO3a激活关系密切。表明间歇运动可能通过激活肾脏miR-155/SⅠRT1/FoxO3a信号通路，抑制其细胞凋亡，显著改善MⅠ大鼠肾脏功能。