墨兰×兔耳兰杂交后代2n雄配子发生及其细胞学机制

郭和蓉，朱娇2，杜国辉，黄紫婷，谢利，魏倩，张志胜

1.华南农业大学林学与风景园林学院/广东省植物分子育种重点实验室，广州 510642；2.山东省农业科学院休闲农业研究所，济南 250100

未减数配子是由于大、小孢子形成和发育过程中出现异常而形成具有孢子体染色体数目(2n)的配子，也被称为2n配子[1]。自然界植物2n配子发生十分普遍[1-3]，2n配子参与下的有性多倍化是植物多倍体形成的主要机制[3-4]，2n配子途径也是人工创造多倍体资源和选育多倍体品种的有效途径[4-6]。因此，研究2n配子发生及其细胞学机制，对深入研究植物多倍体进化机制，创建高效发生2n配子资源，推动多倍体育种均具有重要意义。

兰花2n配子发生已有一些研究报道，兰属兰花(Cymbidium)[6]、蝴蝶兰(Phalaenopsis)[7-8]、石斛兰(Dendrobium)[9-10]等均可产生2n配子，杂种2n配子发生率比非杂种的高[6]。部分学者对百合(Liliumauratum)[13]、香石竹(Dianthuscaryophyllus)[14]、燕麦(Avenaventricosa)[15]和蝴蝶兰[16]等2n配子形成的细胞学机制[11-12]进行了探讨，但在兰属兰花上缺乏系统的研究报道。

多倍体育种是兰花育种的重要方法，目前商业化的蝴蝶兰、石斛兰、大花蕙兰(Cymbidiumhybridum)品种多数为多倍体[17-19]，但墨兰(C.sinense)等国兰商业化的品种均是二倍体。本研究以墨兰、兔耳兰(C.lancifolium)及其杂种后代为材料，探讨兰属兰花2n雄配子发生及其细胞学机制，创建高频发生2n雄配子资源，旨在为国兰多倍体育种和兰花多倍体进化研究积累材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为‘小香墨兰’(C.sinense‘Xiao xiang’)、兔耳兰及其31份杂交后代，杂交后代中的30份材料用于2n雄配子发生途径观察，1份材料用于小孢子母细胞减数分裂过程观察。上述材料种植于华南农业大学增城基地兰花大棚中，常规栽培管理。植株开花后，取不同发育时期的花朵或花粉块固定。

1.2 细胞学观察

取‘小香墨兰’、兔耳兰及其30份杂交后代成熟花粉期的花粉块和编号45-1 后代不同发育时期花朵或花粉块于卡诺固定液(V95%乙醇∶V冰乙酸=3∶1)中固定24 h，然后转移至70%乙醇于4 ℃冰箱保存备用。

参考周建金等[20]的方法制片，制片后在Olympus-I×71倒置显微镜和ZEISS光学显微镜下观察，每片随机选择10个视野拍照。每份材料观察3个花粉块，观察小孢子母细胞减数分裂时，在40×或100×下拍照，以100个小孢子母细胞为1次重复，重复3次。

1.3 统计分析

二分体发生率=(二分体个数/观察总孢子数)×100%；三分体发生率=(三分体个数/观察总孢子数)×100%；二分体途径对未减数雄配子发生的贡献率=(二分体途径产生的未减数雄配子数/未减数雄配子总数)×100%；三分体途径对未减数雄配子发生的贡献率=(三分体途径产生的未减数雄配子数/未减数雄配子总数)×100%；未减数雄配子发生率=(N2D+NTr)/T×100%，其中D代表二分体，Tr代表三分体，T代表总花粉数。

数据采用SPSS 18.0软件进行统计分析，以邓肯氏新复极差法(Duncan’s)测验在α=0.05水平上的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 ‘小香墨兰’×兔耳兰杂交后代2n雄配子发生

试验结果(图1)显示，30份‘小香墨兰’×兔耳兰杂交后代2n雄配子发生率3 a平均为2.28%，显著高于‘小香墨兰’(0.19%)和兔耳兰(0.22%)，表明种间杂交显著提高了杂种后代2n雄配子发生率。不同 ‘小香墨兰’×兔耳兰杂交后代的2n雄配子发生率不同(表1)，平均值变幅为0.87%～ 6.07%。后代45-60 的2n雄配子发生率最高,为6.07%;45-29的发生率最低,为0.87%。年份对大多数杂种后代2n雄配子发生率影响显著，但对 45-113、45-116、45-105和45-29等杂交后代影响不显著。

不同小写字母表示差异显著，P<0.05。Means in the same column with different small letters indicated significant difference at α=0.05 level.

表1 不同年份‘小香墨兰’×兔耳兰杂交后代2n雄配子发生率Table 1 The occurrence frequency of unreduced male gamete in hybrids of C. sinense ‘Xiaoxiang’ × C. lancifolium %

续表1 ContinuedTable 1

2.2 ‘小香墨兰’×兔耳兰杂交后代2n雄配子发生途径

对‘小香墨兰’×兔耳兰杂交后代2n雄配子发生途径进行了鉴定。结果(图2)显示，在‘小香墨兰’×兔耳兰杂交后代的花粉块中，除了正常的四分体外，还有一定比例的二分体(图2A)和三分体(图2B)，二分体中有2个2n雄配子，三分体包含了1个2n雄配子和2个n配子。说明‘小香墨兰’×兔耳兰杂交后代2n雄配子发生主要为二分体和三分体途径。

A：45-51成熟花粉，箭头示二分体；B：45-98成熟花粉，箭头示三分体。A：Maturepollen of 45-51，dyads(arrow)；B：Mature pollen of 45-98，triads(arrow).

结果显示，所有杂交后代2n雄配子发生均通过二分体和三分体途径，但不同后代2n雄配子发生的主要途径不完全相同(图3)。二分体途径对 45-60、45-51、45-41、45-109和45-2等后代2n雄配子形成的贡献率分别为63.98%、64.41%、78.91%、72.23%和79.24%,因此，这些后代2n配子形成主要通过二分体途径。三分体途径对45-39、45-18、45-85、45-66和45-5等后代2n雄配子形成的贡献率分别为70.37%、77.39%、85.20%、85.33%和88.04%，其2n雄配子形成主要通过三分体途径。

图3 ‘小香墨兰’×兔耳兰杂交后代二分体和三分体的平均发生率Fig.3 Average incidence of dyads and triads in hybrids of C. sinense ‘Xiaoxiang’ ×C. lancifolium

2.3 ‘小香墨兰’×兔耳兰杂交后代2n雄配子发生的细胞学机制

‘小香墨兰’×兔耳兰杂交后代45-1的2n雄配子发生率为4.94%。对其小孢子母细胞减数分裂过程进行观察(图4)，结果显示：45-1小孢子母细胞减数分裂存在不同步现象，在中期Ⅰ，5.79%小孢子母细胞仍处在终变期(图4A)，这些小孢子母细胞不进行减数分裂第一次分裂(图4B)，而直接进行减数分裂第二次分裂(图4C)，形成二分体，最终发育成2个2n雄配子(图4F)。

A：中期Ⅰ，示处于中期Ⅰ(箭头)和终变期小孢子母细胞(箭头)，Bar=10 μm；B：后期Ⅰ，示未进行第一次分裂的小孢子母细胞，Bar=20 μm；C：中期Ⅱ，示未分裂的小孢子母细胞染色体排列在赤道板上(箭头)，Bar=20 μm；D：中期Ⅱ，示融合纺锤体(长箭)、垂直纺锤体(短箭)和平行纺锤体(箭头)，Bar=20 μm；E：后期Ⅱ，示融合纺锤体引起两组染色体被牵引至同一子细胞中(箭头)，Bar=10 μm；F：成熟花粉期，示二分体(箭头)和四分体(箭头)，Bar=10 μm；G：中期Ⅱ，示三极纺锤体(箭头)和平行纺锤体，Bar=10 μm；H：后期Ⅱ，示2组染色体被牵引至同一子细胞中(箭头)，Bar=20 μm；I：成熟花粉期，示三分体，包含1个2n花粉(箭头)和2个n配子(箭头)，Bar=10 μm。 A：Meiosis metaphaseⅠ，indicating microsporocyte at metaphaseⅠ(arrow) and diakinesis (arrow )，Bar=10 μm；B：AnaphaseⅠ，indicating microsporocyte failed to carry out meiosisⅠ(arrow)， Bar=20 μm；C：MetaphaseⅡ，indicating chromosomes arranged on the equatorial plate of the microsporocyte failed to carry out meiosisⅠ(arrow)，Bar=20 μm；D：MetaphaseⅡ，indicating fused (long arrow)，parallel(short arrow)and perpendicular(arrow )spindles，Bar=20 μm；E：AnaphaseⅡ，indicating two set of chromosomes being pulled to one daughter cell by fused spindle，Bar=10 μm；F：Mature pollen stage，indicating dyad(arrow) and tetrad(arrow)，Bar=10 μm；G： MetaphaseⅡ，indicating parallel and tripolar spindle，Bar=10 μm；H：AnaphaseⅡ，indicating two sets of chromosomes being pulled to one daughter cell(arrow)，Bar=20 μm；I：Mature pollen stage，indicating triad with one 2n gamete(arrow) and two n gametes(arrow )，Bar=10 μm.

在减数分裂中期Ⅱ，1.63%二分体形成融合纺锤体(图4D)，导致后期Ⅱ(图4E)两套染色体进入同一个子细胞形成2个2n雄配子(图4F)；4.63%二分体形成三极纺锤体(图4G)，导致在减数分裂第二次分裂后期，2组染色体进入同一子细胞中，另2组染色体分别进入不同子细胞(图4H)，形成三分体(图4I)，产生1个2n雄配子和2个n雄配子。

3 讨 论

高效发生2n配子资源的创建有助于利用2n配子途径选育多倍体植物新品种。已有研究表明，不同种植物、同种植物不同个体2n配子发生率差异明显[2-3]，远缘杂交是获得高效发生2n配子资源的有效手段[6,21]。本研究中墨兰和兔耳兰种间杂交后代2n雄配子发生率显著高于亲本，45-60的 2n雄配子发生率是其父本的30倍、母本的32倍，45-51、45-15等后代2n雄配子平均发生率大于3%，每年发生率均在1%以上，这些资源的获得为国兰多倍体育种提供了亲本材料。

兰花小孢子形成过程中，减数分裂前加倍，减数分裂Ⅰ、Ⅱ后期失调，不进行减数分裂Ⅰ或Ⅱ以及减数分裂Ⅱ纺锤体的异常是2n雄配子和多倍体配子发生的主要原因[22]。本研究发现，墨兰和兔耳兰种间杂种2n雄配子均通过二分体和三分体方式产生，二分体是由于小孢子母细胞减数分裂不同步，导致减数分裂Ⅰ不分裂，而减数分裂Ⅱ正常分裂或由于减数分裂Ⅱ细胞纺锤体异常定向，形成融合纺锤体所致；三分体的形成都是由于减数分裂Ⅱ纺锤体异常定向形成三极纺锤体所致。这一结果与前人在其他品种兰花上的研究结果[16,22]不完全一致，朱娇等[16]对蝴蝶兰未减数配子发生机制的研究结果表明，二分体的形成是由于小孢子母细胞减数分裂不同步导致的，没有发现因减数分裂Ⅱ纺锤体异常定向导致二分体发生的现象，这可能是材料不同所致。进一步的研究表明，不同后代2n雄配子发生途径不完全相同，一些后代主要通过二分体方式产生，另一些后代则主要通过三分体途径发生，说明2n雄配子发生受多基因控制，鉴定、克隆和解析这些基因的功能将成为今后研究的主要方向之一。

2n配子发生主要受遗传因素控制[12,23]，但外界环境也会在很大程度上影响其发生频率[14,24-26]，如高温[27-28]和低温[29-30]是具有重要影响的环境因素。Zhou等[14]研究表明，香石竹同一品种在3月、6月、9月和12月的2n雄配子发生率差异明显，月份对不同品种2n雄配子发生影响也不同。本研究对30份杂交后代连续3 a的观测结果也表明，墨兰和兔耳兰多数杂交后代不同年份间的2n配子发生率差异显著，且2n配子发生率高的后代年份间差异大，其原因有待进一步研究。