G-test在肝细胞癌筛查中的诊断价值

杨雪 陆观珠 杜成坎 王博成 许洁 包玉洁

全球每年原发性肝癌发病率位居新发恶性肿瘤的第6位，病死率占恶性肿瘤的第3位[1-2]。肝细胞癌(HCC)的预后不良，早期HCC患者可通过手术切除治愈及改善预后，但我国原发性肝癌患者的5年生存率仅为12%[3]。HCC发病隐匿，发现时常已至疾病晚期，严重影响患者长期生存[4]。因此，提高早期诊断率对于提高患者预后具有重要意义。

有研究提示寡糖链作为生物标志物诊断HCC有着重要的意义[5-8]。本研究使用荧光毛细血管法寡糖链检测(G-test)试剂盒对患者中血清多组寡糖链进行检测，旨在探讨多组寡糖链是否能够作为HCC诊断的血清标志物，并联合常用标志物甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)以提高HCC的诊断率。

资料与方法

一、研究对象

本研究为回顾性研究，收集2019年1月至8月上海交通大学医学院附属第九人民医院感染科住院的HCC及有高危因素的非HCC慢性肝病患者。

纳入标准：①年龄大于18岁；②临床诊断为HCC患者及考虑存在HCC高危因素的非HCC慢性肝病患者。原发性HCC诊断标准：依据《原发性肝癌诊疗规范(2017年版)》，病理诊断为HCC，伴或不伴其他部位转移，慢性乙型病毒性肝炎依据《慢性乙型肝炎防治指南(2019版)》。

排除标准：①急性病毒性肝炎患者；②合并其他部位的原发性肿瘤；③合并妊娠或者哺乳期妇女；④既往诊断有其他肿瘤；⑤近期有胎盘或含胎盘成分中药服用者。

三、研究方法

通过对患者两种血清标志物进行检测，统计学分析两者对HCC的诊断价值：应用G-test法寡糖链检测试剂盒(江苏,先思达)，使用ABI3500Dx基因分析仪(Applied Biosystems)对样本进行毛细管电泳得到糖组学图谱，对检测的9个寡糖链组分的含量进行图谱分析，检测取G值为5作为标准，≥5为阳性，<5为阴性，检测在上海市儿童医院检验科完成。应用甲胎蛋白试剂盒(雅培) 使用雅培i2000全自动化学发光免疫分析仪检测患者血清中AFP定量值，参考值为0～15 ng/mL，检测在上海交通大学附属第九人民医院检验科完成。

四、统计学分析

采用SPSS23.0(IBM,USA)进行统计学分析，采用ROC曲线进行诊断效能分析，采用z检验比较不同参数间AUC，采用卡方检验比较不同组间G-test阳性率一致性。使用Mcnemar检验对比组间AUC的差异。P<0.05为判定结果具有统计学差异。

结 果

一、研究对象的基本资料

本研究数据共收集病例73例，确诊HCC患者30例及有高危因素的非HCC慢性肝病患者43例的血清样本，其中男性54例，女性19例，年龄分布24～92岁(中位年龄56岁)(表1)。

表1 研究对象基本情况

二、G-test和AFP检测结果

经确诊的30例HCC患者中使用G-test 检测方法阳性率90.0%(27/30)，AFP检测阳性率50.0%(15/30)；非HCC患者中G-test 检测方法阳性率46.5%(20/43)，AFP在非HCC患者中的阳性率13.9%(6/43)(表2)。

表2 G-test和甲胎蛋白的检测结果

经过卡方检验，非HCC组G test阳性率低于HCC组，P=0.000，非HCC组AFP阳性率低于HCC组，P=0.001，具有统计学差异。

通过卡方检验，两组间性别、ALT分布未见显著性差异(P>0.05)。通过独立样本t检验，HCC组年龄高于非HCC组，差异具有统计学意义(P<0.05)。

通过ROC曲线下面积计算，单独检测G-test(AUC=0.701)或AFP (AUC=0.680)诊断HCC的敏感性，未见明显统计学差异(P=0.7648)(图1)。

单独检测G-test的AUC为0.701，单独检测AFP的AUC为0.680。使用Z检验，两方法间AUC的P值为0.7648，未见明显统计学差异。图1 独立检测G-test或AFP诊断AFP的灵敏度检测

进一步对比两者在肝细胞癌诊断中的特异度和灵敏度，并使用Mcnemar检验两者之间的差异。在诊断灵敏度中，G-test的灵敏度为86.7%，特异度为53.5%；AFP的灵敏度为50.0%，特异度为86.0%(P<0.05)。以上结果提示G-test的灵敏度显著高于AFP (P=0.003)，而AFP的特异度高于G-test (P=0.003)(表3)。

表3 两种血清标志物诊断效能评价

使用Mcnemar检验，在诊断灵敏度中，G-test的灵敏度为86.7%，特异度为53.5%，P<0.05；AFP的灵敏度为50.0%，特异度为86.0%，P<0.05，差异具有统计学意义。

三、G-test及AFP联合诊断的结果

对G-test与AFP同时阳性，或两者之间有一项阳性的数据进行统计，结果显示：经确诊的30例HCC患者中，G-test和AFP均阳性46.7%(14/30)，G-test和AFP均阴性为10.0%(3/30)，G-test或AFP阳性为43.3%(13/30)；非HCC患者中，G-test和AFP均阳性0%(0/43)，G-test和AFP均阴性为39.5%(17/43)，G-test或AFP阳性为60.5%(26/43)(表4)。

表4 G-test及AFP联合检测结果

对两组检测方法得到的结果计算受试者操作特征曲线(ROC)下面积(AUC)，得到：G-test阳性或AFP阳性的AUC为0.671，两者同时阳性的AUC为0.698。G-test阳性或AFP阳性的患者同时阳性的灵敏度最高，达90.0%，两者同时阳性的特异度最高，为93.0% (图2，表5)。

受试者工作特征曲线(ROC)下面积(AUC)，得到：G-test阳性或AFP阳性的AUC为0.671，两者同时阳性的AUC为0.698。图2 G-test及AFP联合检测受试者工作特征曲线下面积(ROC-AUC)

采用Mcnemar检验分析，G-test阳性或AFP阳性诊断灵敏度高于单独测AFP阳性，具有统计学差异(P<0.05)，甲胎蛋白特异度高于G-test阳性或AFP阳性(P<0.05)。G-test和AFP均阳性的灵敏度与单独AFP阳性未见统计学差异(P>0.05)，G-test和AFP均阳性的特异度度与单独AFP阳性存在统计学差异(P<0.05)(表5)。

表5 G-test及AFP单独及联合检测诊断效能评价

经过卡方检验，HCC组两诊断皆为阳性率高于非HCC组，P<0.05，差异具有统计学意义，HCC组两诊断皆为阴性率低于非HCC组，P<0.05，差异具有统计学意义。

讨 论

由于AFP异质体以及胆管细胞癌中AFP阴性表达，导致AFP用于诊断HCC时，部分患者出现假阴性。对这部分患者的诊断亟需筛选新的敏感的标志物以提高其诊出率[9]。

糖基化是常见的蛋白质翻译后修饰，糖蛋白的N-糖基化分布的改变在恶性肿瘤细胞的增殖、分化、侵袭和转移中起着重要的作用，已有一些糖蛋白作为卵巢癌和乳腺癌生物标志物[10-11]。既往有研究发现糖组学的改变与HCC的发生密切相关，LIU等人发现，在慢性肝病患者与HCC患者血清中N-聚糖之间差异分析，有57种N-聚糖丰度发生显著变化[12]。随后许多研究证实特异性N-聚糖变化与HCC发生相关，提示N-聚糖作为生物标志物诊断HCC有着重要的意义[5-8]。

本研究发现，应用G-test法对寡糖链进行检测，对血清中N-糖链进行荧光标记后检测得到糖组学图谱，并对其结果分析后得到G值对诊断HCC具有较好的诊断意义：针对本次样本中的检测，单独检测G-test的AUC为0.701，单独检测AFP的AUC为0.680。使用Z检验，两方法间AUC的P值为0.7648。未见明显统计学差异。提示G-test与AFP两种方式均可作为HCC诊断的血清标志物。但结果显示：在诊断灵敏度中，G-test的灵敏度为86.7%，显著高于AFP (P=0.003)，更适用于筛选肝细胞癌患者，而AFP的特异度为86.5%，高于G-test (P<0.05)，更适用于排除肝细胞癌诊断；两种检测方式单独使用时均存在一定的不足。当同时使用两种检测方式，且 G-test和AFP二者均为阳性时，诊断患者HCC的灵敏度可达90.0% ，特异度达93.0%，且两者同时阳性的特异度为74.0%。提示两种检测方式联合使用时，可更准确地提高HCC的诊断，减少误诊率和漏诊率。因此，本研究结果提示G-test联合AFP检测可以作为一种非创伤性的检测手段，提高HCC的诊断效力。作为一种血清学标志物检测，该方法更方便易行，两者联合进行HCC诊断突显出其独特的优越性，更有利于在高危因素患者随访过程中使用。

本研究样本量较少，后续笔者会扩大样本量验证本研究结果。其次，本研究持续时间较短，未能追踪高危患者中G-test阳性高危患者的HCC发病情况。在未来的研究中有必要开展大样本多中心前瞻性研究确证本研究结果。