Sirt1抑制由ox-LDL诱导的人冠状动脉内皮细胞的炎症反应

魏明慧，孙浩荣，王静文，薛明明＊

（内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特 010059）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是心脏病、外周血管病、脑血管病等疾病的重要发病机制[1]。AS的发病率居高不下，是世界上最重要的公共卫生问题之一。中国AS的发病率也急剧上升[2]。研究表明炎症反应参与AS发病的各个阶段，在初期表现为急性渗出性炎症，在晚期以慢性增生性炎症为特征[3]。因此，抑制炎症可能成为治疗AS的有效方法。研究报道[4]氧化型低密度脂蛋白（oxidized lowdensity lipoprotein，ox-LDL）与AS、高血压、冠状动脉及外周动脉疾病、急性冠脉综合征等心血管疾病密切相关，是AS的独立危险因素。沉默信息调节因子（silent information regulator，Sirt）1作为SIRT蛋白家族中最具代表性的因子，具有脱乙酰酶活性，可修饰脂质，促进自噬，减轻炎症，改善血管内皮细胞功能[5]。本文利用人冠状动脉内皮细胞（human coronary endothelial cells，HCAEC）建立ox-LDL诱导的AS细胞模型，探讨Sirt1对HCAEC炎症反应的影响。以期为AS的治疗提供新的药物靶点和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

HCAEC、ECM内皮细胞培养基购自美国Sciencell公司；ox-LDL购自上海翊圣生物科技有限公司；GV146-SIRT1过表达质粒（货号：POSE146071634）、GV102-SIRT1干扰质粒（货号：PIEE102071634）购自上海吉凯基因有限公司；总RNA提取试剂盒购自北京TIANGEN生化科技有限公司（货号：RP120227），Lipofectamine™2000 Transfection Reagent（货号：11668019）购自Thermo Fisher科技（中国）有限公司，Anti-GAPDH抗体-Loading Control（货号：ab9485）、重组Anti-SIRT1抗体[EPR18239]（货号：ab189494）、重组Anti-ICAM1抗体[EP1442Y]（货号：ab53013）均购自Abcam上海有限责任公司；Dylight800，Goat Anti-Rabbit IgG（货号：A23920）购自Abbkine公司；人hs-CRP ELISA试剂盒、人IL-1 ELISA试剂盒购自深圳达科为生物工程有限公司；TransStart Tip Green qPCR SuperMix、PrimeScript RT Master Mix、RNAiso Plus购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养将HCAEC中加入含10%FBS的ECM培养基并置于37℃，5%CO2培养箱内，每隔24h采用半数换液原则弃掉一半培养基再加入一半新的含10%FBS的ECM培养基，当细胞融合度约为85%~90%并处于对数生长期时，以1：2的比例进行传代培养。

1.2.2 四噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞生存率 将HCAEC以1×104/mL的浓度稀释，接种在96孔板中，每孔100μL。在37℃，5%CO2的条件下培养24h。用ECM培养基稀释250mg/Lox-LDL，制备25mg/L ox-LDL、50mg/Lox-LDL组、100mg/L ox-LDL组、200mg/L ox-LDL四个浓度，用ECM培养基稀释PBS磷酸盐缓冲液制备与200mg/Lox-LDL同等条件的PBS培养液。取出生长24h的贴壁细胞，弃去各孔中原培养液，每孔加入100L含各浓度ox-LDL的ECM培养基，每个浓度设置3个复孔，37℃、5%CO2条件下继续培养24h。在每孔中加入20μL 5mg/mL的MTT溶液；继续放入培养箱中避光培养4h，弃上清，各孔加入100μL DMSO，振荡10min；全波长酶标仪上测定每孔在450nm处OD值。根据公式：细胞存活率=（样本孔OD值—空白孔OD值）/（正常对照孔OD值—空白孔OD值）计算各浓度下细胞存活率。

1.2.3 细胞转染与实验分组 取对数生长期的HCAEC，以每孔2.5×105个细胞接种于24孔板中，每组三个复孔。正常对照组细胞常规培养；空质粒+正常对照组细胞转染空载质粒；空质粒+ox-LDL组转染空载质粒并用100 mg/L ox-LDL诱导HCAEC损伤，建立AS细胞模型；Sirt1过表达+ox-LDL组、Sirt1干扰+ox-LDL组分别转染Sirt1过表达和Sirt1干扰重组质粒并用100 mg/L ox-LDL诱导HCAEC损伤，建立AS细胞模型。用LipofectamineTM2000转染试剂介导质粒转染，48h后在荧光显微镜下观察各组细胞转染情况。

1.2.4 qRT-PCR检测Sirt1和ICAM-1的mRNA表达水平 提取各组细胞总RNA，逆转录的cDNA为模板，构建20μL的反应体系，使得正反向引物的终浓度为0.3M；设定95℃，15min预变性；95℃，10s，60℃，32s共40个循环进行变性、退火、延伸并采用7500 Fast检测系统、SuperReal PreMix Plus、表1中的引物序列进行聚合酶链式反应。使用2-ΔΔCt对qPCR结果进行定量，以GAPDH作为内参，每个样品重复3次。

表1 用于荧光定量聚合酶链式反应的引物序列Fig.1 Primers sequences used for reverse-transcription quantitative polymerase chain reaction analysis.

1.2.5 Western Blot分析Sirt1、ICAM-1的蛋白表达水平 用含有1%蛋白酶抑制剂（PMSF）的蛋白裂解液RIPA充分裂解细胞，并将裂解物在4℃下12000r离心20min取上清；将等量的蛋白以每孔10μg的量进行SDS-PAGE凝胶电泳，电转移到PVDF膜上；在室温下用5%脱脂牛奶封闭1.5h，并在4℃分别用Anti-GAPDH抗体-Loading Control（货号：ab9485）、重组Anti-SIRT1抗体[EPR18239（]货号：ab189494）、重组Anti-ICAM1抗体[EP1442Y]（货号：ab53013）以1：1000的比例稀释后孵育过夜；最后将膜与Dylight800，Goat Anti-Rabbit IgG（货号：A23920）室温孵育2h，并用双色红外激光成像系统（LI-COR公司）进行扫膜成像；结果用目的基因的灰度值/GAPDH的灰度值表示。

1.2.6 ELISA法检测IL-1、hs-CRP表达 用无菌EP管收集各组的上清液，以10μL/孔加入样本孔内，再加入40μL样本稀释液；标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；随后在每孔内加入辣根过氧化氢酶标记的检测抗体100μL 37℃水浴60min；弃去孔内液体，用洗涤液洗板5次；每孔加入底物A、B各50L37℃避光孵育15min；最后每孔加入50uL终止液，在450nm波长处测定各孔OD值；根据标准品孔的OD值绘制标准曲线，并将样本孔的OD值代入到标准曲线，计算样本孔IL-1、hs-CRP的浓度。

1.3 统计学分析

所有实验数据用来表示并利用SPSS 22.0进行统计学分析。多组间比较用单因素方差分析，组间的两两比较用独立样本t检验。P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 100 mg/L ox-LDL成功诱导HCAEC构建AS细胞模型

将正常对照组的细胞存活率定为100%，而其他组的细胞存活率以对照组的百分比表示；MTT试验结果显示，与正常对照组相比，PBS对照组的细胞存活率无显著差异（P>0.05）。然而，随着ox-LDL浓度的进一步增加，细胞存活率逐渐降低，在200 mg/L ox-LDL组细胞存活率显著降低（P<0.05）（见图1）。这些结果表明ox-LDL以剂量依赖的的方式降低细胞存活率。因此，在以下实验中排除200mg/L ox-LDL组。为了进一步筛选出诱导炎症的最适ox-LDL浓度，通过qRT-PCR和Western Blot检测了诱导炎症部位黏连性的ICAM-1表达的变化；ELISA法检测各组细胞上清中炎症因子IL-1、hs-CRP的表达变化。与正常对照组相比，50 mg/L ox-LDL组ICAM-1的mRNA以及蛋白显著升高（P<0.05），而100 mg/L ox-LDL组升高更为显著（P<0.01）。然而，其他组与正常对照比较均无显著差异（见表2，图2）。与对照组相比，上清液中炎症因子IL-1、hs-CRP蛋白表达量在100 mg/L ox-LDL组均显著升高（P<0.01），IL-1蛋白表达量在50mg/L ox-LDL组也显著升高（P<0.05），但没有100 mg/L ox-LDL组升高明显，其余组与正常对照组间也无显著差异（见表3）。

图1 不同浓度ox-LDL对细胞存活率的影响Fig.1 Effects of different concentrations of ox LDL on cell viability

表2 各组HCAEC中ICAM-1的mRNA表达情况（±s）Tab.2 Expression of ICAM-1 mRNA in HCAECof each group（±s）

表2 各组HCAEC中ICAM-1的mRNA表达情况（±s）Tab.2 Expression of ICAM-1 mRNA in HCAECof each group（±s）

注：与正常对照组比较，#P<0.05，＊P<0.01

组别nmRNA（相对于正常对照组）正常对照组31 PBS组31.051±0.085 25 mg/L ox-LDL组31.069±0.063 50 mg/L ox-LDL组31.478±0.063#100 mg/L ox-LDL组32.041±0.071*

图2 不同浓度ox-LDL对ICAM-1蛋白表达的影响Fig.2 Effects of different concentrations of ox-LDL on ICAM-1 protein expression

表3 各组细胞上清液中炎症因子的比较（±s）Tab.3 Comparison of inflammatory factors in cell supernatan（t±s）

表3 各组细胞上清液中炎症因子的比较（±s）Tab.3 Comparison of inflammatory factors in cell supernatan（t±s）

注：与正常对照组比较，#P<0.05，＊P<0.01

组别nIL-1（pg/mL）hs-CRP（pg/mL）正常对照组31.621±0.0611.663±0.045 PBS组31.602±0.0391.656±0.057 25μg/mL ox-LDL组31.646±0.0461.848±0.126 50μg/mL ox-LDL组31.731±0.0344.511±0.139#100μg/mLox-LDL组32.889±0.113*7.366±0.240*

2.2 Sirt1成功转入AS模型细胞并表达

重组质粒含有EGFP绿色荧光报告基因，转染48 h后转染了空质粒、Sirt1干扰、Sirt1过表达的细胞在荧光显微镜下可见绿色荧光标记。而正常对照组的细胞未见绿色荧光（见图3）。为了进一步验证目的基因Sirt1是否成功表达，通过qRT-PCR和Western Blot检测各组细胞Sirt1的表达情况。正常对照组细胞与转染空质粒的对照组间无显著差异（见表4，图4）。与转染空质粒的对照组相比，转染空质粒的模型组Sirt1 mRNA及蛋白表达量显著降低（P<0.05）。与转染空质粒的模型组相比，转染Sirt1过表达质粒的模型组Sirt1 mRNA及蛋白表达量显著升高（P<0.05），而转染干扰质粒的模型组Sirt1 mRNA及蛋白表达量则显著降低（P<0.05）。

图3 各组细胞质粒转染情况.标尺：500μm.Fig.3 Plasmid transfection in each group.Scale:500μm.

表4 各组细胞中Sirt1的mRNA和蛋白表达情况（±s）Tab.4 Expression of Sirt1 mRNAand protein in each group（±s）

表4 各组细胞中Sirt1的mRNA和蛋白表达情况（±s）Tab.4 Expression of Sirt1 mRNAand protein in each group（±s）

注：与空质粒对照组比较，#P<0.05；与空质粒+ox-LDL组比较，＊P<0.05

组别nmRNA（相对于正常对照组）正常对照组31空质粒对照组30.995±0.096空质粒+ox-LDL组30.480±0.101#Sirt1过表达+ox-LDL组31.992±0.100*Sirt1干扰+ox-LDL组30.167±0.076*

图4 各组细胞Sirt1蛋白的表达Fig.4 Expression of Sirt1 protein in each group

2.3 S irt1减轻ox-LDL诱导的HCAEC炎症反应

为了证实Sirt1对于ox-LDL诱导的HCAEC炎症反应的影响，通过qRT-PCR和Western Blot检测了促进炎症部位黏连的ICAM-1。正常对照组与空质粒对照组间无显著差异；与空质粒对照组相比，空质粒+ox-LDL组ICAM-1 mRNA表达水平显著升高（P<0.05）；与空质粒+ox-LDL组比较，Sirt1过表达+ox-LDL组ICAM-1 mRNA表达水平显著降低，而Sirt1干扰+ox-LDL组则显著升高（P<0.05）。这些结果通过Western Blot得到了进一步证实（见图5）。此外通过ELISA法检测各组细胞上清中炎症因子IL-1、hs-CRP表达水平，与空质粒对照组相比，空质粒+ox-LDL组IL-1、hs-CRP表达水平升高（P<0.05）；与空质粒+ox-LDL组比较，Sirt1过表达+ox-LDL组IL-1、hs-CRP表达水平显著降低，而Sirt1干扰+ox-LDL组IL-1、hs-CRP表达水平则显著升高（P<0.05）（见表6）。

表5 各组HCAEC中ICAM-1 mRNA及蛋白的表达情况（±s）Tab.5 Expression of ICAM-1 mRNA and protein in HCAEC of each group（±s）

表5 各组HCAEC中ICAM-1 mRNA及蛋白的表达情况（±s）Tab.5 Expression of ICAM-1 mRNA and protein in HCAEC of each group（±s）

注：与空质粒对照组比较，#P<0.05；与空质粒+ox-LDL组比较，＊P<0.05

组别nmRNA（相对于正常对照组）正常对照组31空质粒对照组31.007±0.007空质粒+ox-LDL组32.182±0.496#Sirt1过表达+ox-LDL组30.542±0.150*Sirt1干扰+ox-LDL组36.574±0.524*

图5 各组细胞ICAM-1蛋白的表达Fig.5 Expression of ICAM-1 protein in each group

表6 各组HCAEC中IL-1、hs-CRP水平的比较（±s）Tab.6 Comparison of IL-1 and hs-CRP levels in HCAEC of each group（±s）

表6 各组HCAEC中IL-1、hs-CRP水平的比较（±s）Tab.6 Comparison of IL-1 and hs-CRP levels in HCAEC of each group（±s）

注：与空质粒对照组比较，#P<0.05；与空质粒+ox-LDL组比较，＊P<0.05

组别nIL-1（pg/mL）hs-CRP（pg/mL）正常对照组31.629±0.1121.603±0.136空质粒对照组31.644±0.0941.602±0.141空质粒+ox-LDL组32.718±0.277#7.204±0.628#Sirt1过表达+ox-LDL组31.026±0.104*2.691±0.620*Sirt1干扰+ox-LDL组34.320±0.225*11.382±0.992*

3 讨论

尽管血液中存在大量的抗氧化剂，但ox-LDL不仅可以在动脉粥样硬化斑块中被发现，而且在血浆或血清中也大量存在，因此ox-LDL被作为心血管疾病的血清学标志物[6]。我们分别用25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L ox-LDL刺激HCAEC，结果发现在200 mg/L ox-LDL的诱导下显著降低了细胞的存活率，而100 mg/L ox-LDL能够诱导HCAEC产生炎症因子ICAM-1、IL-1、hs-CRP，并且没有显著影响细胞存活率。这与Zu F等人在ox-LDL诱导的微粒通过ICAM-1促进内皮单核细胞粘附的研究中相符[7]。因此我们选用100 mg/L ox-LDL刺激HCAEC，在体外建立AS细胞模型。

目前，Sirt1在脂肪组织炎症中起着屏障作用，在抗炎过程中占有重要地位[8]。在本研究中，我们选用Sirt1基因过表达和干扰重组质粒，选择毒性较小的脂质体转染法介导Sirt1转染于AS细胞模型，并通过质粒携带的EGFP绿色荧光标记及qRTPCR、Western blot实验判断Sirt1转染效率。白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）可以诱导人血管内皮细胞的各种炎症功能，包括促凝血活性、粘附分子表达增加、白细胞募集和单核细胞趋化蛋白-1的产生[9]。高敏C反应蛋白（high sensitive C-reactive protein，hs-CRP）由于其对心血管疾病早期预测的灵敏性高而得名[10]。hs-CRP被认为在早期AS患者中显著增加，并与疾病严重程度及其并发症相关，因此常被作为AS的预测因子[11]。细胞间黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule，ICAM-1）是一种介导黏附反应的重要分子。Marzolla等人研究发现，内皮细胞盐皮质激素受体可转录调控ICAM-1的表达促进由醛固酮诱导的动脉粥样硬化[12]。因此，本实验选用以上三种在AS的发生发展中具有代表性的炎症因子作为研究对象探讨Sirt1在HCAEC内发挥的抗炎作用。我们发现，Sirt1过表达能显著抑制炎症因子IL-1、hs-CRP及ICAM-1的表达，Sirt1干扰则显著促进了炎症因子IL-1、hs-CRP及ICAM-1的表达。因此我们认为Sirt1在体外AS模型细胞中发挥抗炎作用。

综上所述，体外实验结果表明Sirt1可能在HCAEC中抑制由ox-LDL诱导的炎症反应，进而对人冠状动脉内皮细胞起到保护作用。但其具体机制仍有待于我们的进一步研究。