东北地区秋子梨果实糖酸、酚类成分及其生物活性分析

曹晓云 ，刘永富 ，石娟华，刘 畅，王 强，张茂君，汪晓谦，杜国栋

（1.沈阳农业大学园艺学院，沈阳 110161；2.河北省邯郸市永年区自然资源和规划局，河北邯郸057150；3.吉林省农业科学院果树研究所，吉林公主岭136100）

梨是世界上最重要的果树之一，其果实因良好的风味和较高的营养价值而备受人们青睐。果实中糖酸的组成和含量直接影响梨果风味，主要反映梨果口感[1-2]。酚类物质对梨果颜色及营养保健功效的形成有重要作用[3-4]，如黄酮类物质有多种药理活性，具有镇痛、抗炎、抗氧化等多种功效[5-6]。在我国，梨的栽培已有3000 多年的历史，种质资源十分丰富[7]，不同地域不同品种间营养物质含量差异较大。秋子梨（Pyrus ussuriensisMaxim.）是我国东北地区主要的梨栽培种类[8]，包括南果梨、京白梨、花盖梨等优良品种，在寒地果树生产中有十分重要的地位。关于梨果实的化学成分和抗氧化能力已有报道，但主要针对砂梨和西洋梨进行研究，对秋子梨的品质、酚类成分及生物活性研究甚少[9-10]。本研究对6个常见秋子梨品种果实的糖酸、酚类成分进行分析比较，并对其抗氧化、抗炎及抑菌效果进行详细研究，研究结果对于秋子梨品种资源的进一步利用具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

供试6个秋子梨栽培品种（尖把梨、南果梨、京白梨、安梨、大香水和红花盖）的果实材料取自国家果树种质公主岭寒地果树资源圃。根据果实切面淀粉染色的程度确定最佳采收期[11]，在染色程度达到40%之前采收。试验设3次重复，每个重复取10个大小一致的果实，去除果核，将果皮和果肉分离并置于-80°C冰箱备用。

1.2 方法

1.2.1 糖和有机酸的提取和分析 分别称取果皮或果肉样品0.2g，加入2mL去离子水进行糖和有机酸的提取，离心后取上清液，重复提取2次，过0.22μm水系滤膜，之后在配有二极管阵列检测器和自动进样器的Agilent1200液相色谱仪上进行检测，重复3次。糖的分离使用Carbomix Ca-NP色谱柱（300mm×7.8 mm，10μm；美国赛分科技），流动相为去离子水，流速0.6mL·min-1。有机酸的分离使用ZORBAX SB-Aq色谱柱（250×4.6mm，5μm；美国安捷伦），流动相为20mmol·L-1NaH2PO4（pH 值2.6），流速0.7mL·min-1。

1.2.2 果实提取液的制备 参照WANG等的方法制备提取液[12]。2.0g样品加入20mL提取液（70%甲醇），振荡（1500r·min-1，15℃，1h）提取，离心收集上清液，重复提取2次后，使用真空浓缩仪进行浓缩（45℃，5.5h），用蒸馏水溶解，于4°C保存，用于酚类物质及生物活性分析。

1.2.3 酚类物质的分析 使用液相质谱联用仪UPLC-MS（Waters）分析果实提取液的酚类物质含量，进样量为10μL。使用Waters Acquity BEH C18色谱柱（2.1mm×50mm，1.7mm）进行梯度分离，流动相由0.1%甲酸水溶液（A）和纯乙腈（B）组成。在梯度洗脱过程中，流速为0.35mL·min-1，流动相比例为2%B（0min），30%B（10min）和95%B（12min）。质谱毛细管电压为2.5kV，离子源温度为150℃，脱溶剂气温度为500℃，脱溶剂气流量为1000L·h-1。

1.2.4 抗氧化能力分析 抗氧化活性采用DPPH自由基清除能力和铁离子还原能力（FRAP）表示，DPPH清除能力测定参考BRAND-WILLIAMS等[13]的方法，FRAP测定参考BENZIE等[14]的方法。使用Trolox作为对照，结果用Trolox当量（TE）的抗氧化能力表示（μmol TE·g-1FW）。

1.2.5 抗炎活性分析 抗炎活性的测定参考SARAVANAN等[15]的方法，略有改动。使用双氯芬酸钠作为标准药物，蒸馏水作为空白对照。将2mL提取液（浓度250μg·mL-1）或标准药物（浓度250μg·mL-1）、2.8mL磷酸缓冲溶液（pH值6.4）、25μL鸡蛋清蛋白进行混合，37℃培养15min。之后在70℃水浴中反应10min，冷却后使用分光光度计在660nm处测定吸光值，试验设3次重复。抗炎率的计算公式为：抗炎率（%）=[（At-Ac）/Ac]×100（At是实验组的吸光度；Ac是对照组的吸光度）。

1.2.6 抑菌效果分析 抑菌效果分析参照李晓东的方法[16]。首先制备牛肉膏蛋白胨固体和液体培养基，使用移液枪吸取300μL大肠杆菌（革兰氏阴性细菌）和金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性细菌）的菌悬液（菌液浓度为106CFUˑmL-1）分别加入培养基，进行平板涂布，静置待表面干燥后使用。将专用的6mm药敏纸片浸入果实提取液1h，之后贴放于平板表面，做好记号，以无菌水浸湿的纸片为阴性对照。37℃恒温培养箱培养24h后，测量抑菌圈的直径，重复3次。

1.3 数据处理方法

试验所得数据结果采用SPSS 17.0软件进行显著性分析，图及主成分分析（PCA）使用Origin 2019b软件完成。

2 结果与分析

2.1 不同秋子梨的糖和有机酸含量

由图1 可知，糖和有机酸的含量因品种和组织部位的不同而差异显著。果皮中的总糖含量为54.02～76.23 mg·g-1，其中南果梨的总糖含量最高，安梨的总糖含量最低。果肉中的总糖含量为73.06～98.22mg·g-1，其中尖把梨的总糖含量最高，大香水的总糖含量最低。在所有梨果实中均检测到果糖、蔗糖、山梨糖醇和葡萄糖。果皮中南果梨的果糖和葡萄糖含量最高，分别为32.59mg·g-1和18.20mg·g-1，尖把梨的蔗糖含量最高，为29.74mg·g-1。果肉中南果梨的果糖含量最高，为49.41 mg·g-1，尖把梨的蔗糖含量最高，为41.34mg·g-1。

图1 不同秋子梨果皮和果肉的糖和有机酸含量Figure 1 Sugar and organic acid composition in the peel and flesh of Pyrus ussuriensis cultivars

秋子梨中主要的有机酸类型是苹果酸和柠檬酸，其次是奎尼酸，另外含有少量的乳酸和莽草酸。果皮中有机酸的含量为9.94～37.46mg·g-1，其中京白梨的有机酸含量最高，红花盖的有机酸含量最低。果肉中有机酸含量为13.31～66.59mg·g-1，其中尖把梨的有机酸含量最高，京白梨的有机酸含量最低。在所有梨果实中均检测到5 种有机酸，其中苹果酸和柠檬酸是主要的有机酸。果皮中京白梨的苹果酸含量最高，为30.54mg·g-1，其次是尖把梨，为23.52mg·g-1，大香水的柠檬酸含量高，为6.65mg·g-1。果肉中尖把梨的苹果酸含量最高，为46.70mg·g-1，而京白梨的苹果酸含量最低，为9.12mg·g-1，红花盖的柠檬酸含量最高，为25.81mg·g-1。

2.2 不同秋子梨的酚类物质含量

图2 不同秋子梨果皮和果肉的酚类物质含量Figure 2 Phenolic composition in the peel and flesh of Pyrus ussuriensis cultivars

通过UPLC-MS分析，共鉴定到16种酚类物质，包括羟基肉桂酸、对苯二酚、黄烷醇、黄酮醇和花青素（仅在果皮中）。本研究共检测到3种羟基肉桂酸（绿原酸，咖啡酸和对香豆酸），其中绿原酸是主要的种类，果皮中的绿原酸含量最丰富，为100.94～212.97mg·kg-1，果肉中绿原酸的含量为21.16～125.26mg·kg-1（图2）。对苯二酚化合物熊果苷在梨中含量较高。果皮熊果苷的含量为42.58～489.64mg·kg-1，果肉熊果苷含量为4.92～17.26mg·kg-1，其中京白梨的果皮熊果苷含量最高，而尖把梨的果肉熊果苷含量最高。

本研究共检测到4 种黄烷醇，包括2 种单体（儿茶素和表儿茶素）和2 种二聚体（原花青素B1 和B2）。果皮中的黄烷醇含量为67.57～460.48mg·kg-1，果肉中黄烷醇含量为1.18～35.17mg·kg-1。在果皮和果肉中，尖把梨的黄烷醇含量均为最高，而京白梨的含量最低。黄酮醇是另一种重要的类黄酮化合物，UPLC-MS 分析检测到7种黄酮醇，包括4种槲皮素和3种异鼠李素糖苷。果皮中黄酮醇的含量为92.20～677.87mg·kg-1，果肉中为0.84～4.22mg·kg-1。其中，安梨的果皮黄酮醇含量最高，而尖把梨的果肉黄酮醇含量最高。矢车菊素-3-半乳糖苷属花青素类物质，只在红花盖和南果梨的果皮中检测到。总酚和总黄酮含量可用来评价梨果实的营养价值，本研究中，总黄酮含量的变化趋势与总酚含量相似。果皮的总酚含量为354.18～1190.14mg·kg-1，果肉的总酚含量为28.27～182.11mg·kg-1。综合来看，不同品种秋子梨的酚类含量差异较大。果皮中所含的酚类物质含量明显高于果肉，其中尖把梨果肉的总酚含量最高。在果皮和果肉中，尖把梨的黄烷醇和槲皮素衍生物的含量最高，安梨的异鼠李素衍生物的含量最高。

2.3 不同秋子梨的抗氧化活性

由图 3 可知，在果皮中，DPPH 清除能力和铁离子还原能力（FRAP）分别为 13.46～36.87μmol TE·g-1和17.80～39.29μmol TE·g-1。在果肉中分别为3.08～8.71μmol TE·g-1和3.79～14.12μmol TE·g-1。京白梨的果皮提取物的抗氧化能力均为最高，大香水则为最低。

图3 不同秋子梨果皮和果肉的抗氧化活性Figure 3 Antioxidant activities in the peel and flesh of Pyrus ussuriensis cultivars

2.4 不同秋子梨的抗炎活性

由图4 可知，京白梨的果皮提取物抗炎效果最好（抑制率为52.65%），安梨的果皮提取物抗炎效果最差（抑制率为45.37%）。红花盖的果皮提取物抗炎效果最好（抑制率为51.57%），南果梨的果皮提取物抗炎效果最差（抑制率为45.69%）。标准抗炎药物双氯芬酸钠抗炎活性最大，抑制可达52.94%。可见，6 种秋子梨的果皮提取物和果肉提取物均表现出良好的抗炎效果，与标准药物活性接近。

2.5 不同秋子梨的抑菌活性

由表1 可知，供试品种中，果皮与果肉的提取物均显示出有效的抑菌效果，但果皮提取物的抑菌效果更好。另外，果实提取物对金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌效果，而对大肠杆菌的抑菌效果稍差。对不同品种进行比较发现，尖把梨和红花盖的提取物具有较强的抑菌效果。

图4 不同秋子梨果皮和果肉的体外抗炎活性Figure 4 In vitro anti-inflammatory activity in the peel and flesh of Pyrus ussuriensis cultivars

表1 不同秋子梨果皮和果肉的抑菌效果Table 1 Antimicrobial activity in the peel and flesh of Pyrus ussuriensis cultivars

2.6 不同秋子梨的品质指标的主成分分析

对6个品种秋子梨的9个品质指标进行主成分分析（表2），在果皮中，主成分1（PC1）和主成分2（PC2）的方差贡献率累积达到72.57%，其中PC1的方差贡献率达到46.92%，抗氧化活性、总酚、总黄酮、总糖和抑菌效果与PC1有较强的正相关性，而有机酸、体外抗炎活性和抑菌效果与PC2有较强的正相关性。在果肉中，PC1和PC2的方差贡献率累积达到84.77%，其中PC1 的方差贡献达到60.71%，糖酸、抗氧化活性、总酚和总黄酮与PC1 有较强的正相关性，体外抗炎活性和抑菌效果与PC2有较强的正相关性。

表2 不同秋子梨品质指标主成分载荷矩阵Table 2 Principal component loading matrix of quality index of different Pyrus ussuriensis cultivars

表3 表示降维后不同品种在PC1 和PC2 上的得分值。在果皮中，PC1 表示不同品种秋子梨的抗氧化活性、总酚、总黄酮、总糖和抑菌效果的得分情况，不同品种的得分差异较大，其中尖把梨、南果梨和京白梨的得分高于其他秋子梨品种；PC2表示有机酸、体外抗炎活性和抑菌效果的得分情况，尖把梨、京白梨和大香水的得分高于其他秋子梨品种。在果肉中，PC1表示不同品种秋子梨的糖酸、抗氧化活性、总酚和总黄酮含量的得分情况，尖把梨的得分高于其他秋子梨品种；PC2表示不同品种秋子梨的体外抗炎活性和抑菌效果的得分情况，红花盖的得分高于其他秋子梨品种。

表3 不同秋子梨果实品质指标主成分得分Table 3 Component scores of quality index of different Pyrus ussuriensis cultivars

3 讨论与结论

糖酸含量对水果风味有至关重要的影响，糖在梨果实甜度中起关键作用。本研究中共检测到4 种糖（果糖、蔗糖、葡萄糖和山梨糖醇），多数品种中，主要的糖是果糖，而在红花盖中，主要的糖是蔗糖。这些结果与ZHANG 等[17]的发现是一致的，他们的研究表明，蔗糖含量在梨的成熟果实中表现出很大的差异性。本研究的秋子梨品种中共检测到5 种有机酸，其中苹果酸和柠檬酸是主要的有机酸，这与KOLNIAK-OSTEK[18]的研究结果一致。其中，尖把梨不仅苹果酸含量最高，有机酸总量也是最高的。综合分析，秋子梨不同品种和部位间的糖和有机酸含量差异较大。

酚类物质作为植物的次生代谢产物，对秋子梨的颜色、风味和品质等特性产生重要影响。本研究检测到的多酚化合物可分为5 类：羟基肉桂酸，对苯二酚，黄烷醇，黄酮醇和花青素[19]，不同品种和部位的酚类含量差异较大。研究共检测到3 种羟基肉桂酸（绿原酸，咖啡酸和对香豆酸），绿原酸是主要的种类，这与前人研究结果相似[20]。其中，尖把梨的果皮和果肉均检测到较高含量的绿原酸。绿原酸具有多种有益健康的特性，例如抗氧化，抗炎，抗血脂和抗糖尿病等[21]。熊果苷是梨果实中的特有物质[9]，果皮中熊果苷含量高于果肉，其中京白梨的果皮熊果苷含量最高。秋子梨果实中主要的黄烷醇为表儿茶素，是梨原花青素的主要组成单元[22]。黄烷醇对果实品质具有重要意义，其含量直接影响果实风味[23]。在果皮和果肉中，尖把梨的黄烷醇含量均为最高，而京白梨的含量最低。黄酮醇是另一种重要的类黄酮化合物，根据KOLNIAK-OSTEK[19]的报道，黄酮醇在梨果皮中的含量高于果肉，这与本研究结果一致。花青素仅在南果梨和红花盖的果皮中检测到，其含量与前人研究结果接近[24]。

酚类物质与抗氧化能力之间存在显著相关性[25]。LI等[26]研究了10 种海棠果的抗氧化能力，发现总酚和总黄酮的浓度与DPPH、ABTS和FRAP抗氧化能力值显著相关。本研究中也发现了类似结果，总酚含量和总黄酮含量高的品种显示出比其他品种更高的抗氧化能力。因此，可以推断酚类和类黄酮化合物对梨果实的抗氧化能力起主要作用。

抗变性测定是检查抗炎活性的简便方法，热变性蛋白在诱发迟发型超敏反应方面与天然蛋白一样有效[27]。在本试验中，6种梨的果皮提取物和果肉提取物均表现出良好的抗炎活性。另一方面，梨果实提取物具有较高的抑菌活性，但这种活性只在白梨[28]和西洋梨[29]中被报道过。本研究首次证明了秋子梨果实提取物具有较高的抑菌活性。

本研究通过对6 个秋子梨品种的果皮和果肉中的糖酸、酚类成分及其生物活性进行研究，结果表明，果肉中的糖含量明显高于果皮，而抗氧化能力、抑菌效果和酚类含量则呈现相反的趋势。抗炎试验结果表明，6 个秋子梨品种的果皮和果肉提取物均具有较强的抗炎活性。抑菌试验表明，果皮与果肉提取物均显示出较强的抑菌活性，但果皮提取物的抑菌效果更好。不同品种的秋子梨成分和生物活性差异显著，本研究将为这些品种的功能性物质利用奠定基础。