液相色谱-串联质谱同时测定食用植物油中的多种真菌毒素

杨 帅，杨永坛，穆 蕾，杨 霞，杨悠悠*，罗云敬*

（1 北京工业大学生命科学与生物工程学院 北京100124 2 中粮营养健康研究院 营养健康与食品安全北京市重点实验室 北京102209 3 安捷伦科技有限公司 上海200131）

真菌毒素是真菌的次生代谢产物，真菌在一定条件下生长极其迅速，不同菌种产生不同类型的毒素，种类繁多，可导致人和动物急慢性中毒，对人体及动物的健康危害极大[1]。粮食作物在收割过程中因刮伤或储存条件不当，而使真菌毒素迅速累积，造成毒素污染，其污染范围难以控制，危害难以防控[2]。

黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、杂色曲霉素等是食用油中经常出现的毒素种类[3-5]。其中，黄曲霉毒素被世界卫生组织列为“I 类致癌物”，其具有亲肝性，可诱发肝炎、肝硬化、甚至肝癌等恶性疾病，危害极大[6]。北京等地区食用油样品的随机抽取结果显示：黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮均有较高的检出率[7]。为保障公众健康，世界各国均对植物油脂中的部分真菌毒素含量制定了相关规定。我国仅对食用植物油中的黄曲霉毒素B1进行了限量（见GB 2761-2017《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》），规定要求：食用油中黄曲霉毒素B1含量不得超过10 μg/kg，其中花生油和玉米油不得超过20 μg/kg[8]。

目前，真菌毒素的检测手段主要有高效液相色谱法（HPLC）[9-12]、酶联免疫法[13-15]以及液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）[16-19]。其中，酶联免疫法具有简单、快速的优点，多用于单一真菌毒素的快速筛查，其检测结果容易受到基质中的油脂干扰，假阳性高，需要通过其它手段对阳性样品进行确证[15]。高效液相色谱法结合荧光检测器或串联质谱仪是目前主要的真菌毒素检测方法，具有稳定性强、灵敏度高的优点，其前处理多数需要分别配合免疫亲和柱/多功能净化柱使用[20-22]。免疫亲和净化柱是利用抗原抗体的特异性结合达到去除基质中干扰物质的目的，其专一性和选择性较强。然而，键合一种抗体的免疫亲和净化柱只能对单一目标物进行净化，若应用于多毒素筛查则需要对填料进行复配，检测成本昂贵[23-24]。多功能净化柱可应用于多种毒素的筛查，然而多数多功能净化柱用离子交换填料，会吸附食用油中潜在赭曲霉毒素和伏马毒素等酸性化合物[25]，因此不适合多类真菌毒素的同时筛查。

基于此，本研究通过优化提取方法以及优选多功能净化柱，以实现高效快速的样品前处理，再结合液相色谱-串联质谱法对食用植物油中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和伏马毒素等28 种真菌毒素进行风险监测。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

甲醇、乙腈（色谱纯级），美国Sigma 公司；甲酸（色谱纯级），霍尼韦尔贸易（上海）有限公司；甲酸（98%），国药集团化学试剂有限公司；黄曲霉毒素混合标准溶液（AFT B1、B2、G1和G2）、黄曲霉毒素M1（Aflatoxin M1，AFTM1）、HT-2 毒素（HT-2 toxin，HT-2）、T-2 毒素（T-2 toxin，T-2）、赭曲霉毒素A（Ochratoxin A）、伏马毒素B1（Fumonisim B1，FB1）、伏马毒素B2（Fumonisim B2，FB2）、伏马毒素B3（Fumonisim B3，FB3）、呕吐毒素混合标准溶液【包括：脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol）、3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3-Acetyldeoxynivalenol，3-Ac-DON）、15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇（15-Acetyldeoxynivalenol，15-Ac-DON）、雪腐镰刀菌烯醇（Nivalenol，Niv）、3-葡萄糖苷化-脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol 3-glucoside，DON-3-Glu））】，均购自ROMER国际贸易有限公司；渥曼青霉素（Wortmannin，Wor）、赭曲霉毒素B（Ochratoxin B，OTB）、黄曲霉毒素M2（Aflatoxin M2，AFTM2），均购自北京振翔科技有限公司；新茄病镰刀菌烯醇（Neosolaniol，Neo）、蛇形毒素（Diacetoxyscirpenol，Dia）、杂色曲霉素（Sterigmatocysin，Ster）、玉米赤霉烯酮（Zearalenone）、α-玉米赤霉烯醇（α-Zearalenol，α-ZEL）、β-玉米赤霉烯醇（β-Zearalenol，β-ZEL）、玉米赤霉酮（Zearalanone，ZAN）、α-玉米赤霉醇（α-zearalanol，α-ZAL）、β-玉米赤霉烯醇（β-zearalanol，β-ZAL），均购自上海安谱科技实验股份有限公司。

LC-30AD 高效液相色谱仪，日本岛津公司；QTRAP 5500 三重四级杆质谱仪，美国AB Sciex公司；Allegra 64R 台式高速离心机，美国贝克曼公司；TTL-DCⅡ型氮吹仪，北京同泰联科技发展有限公司；Milli Q 超纯水机，美国Millipore 公司；Captival EMR-Lipid 固相萃取净化柱，美国安捷伦公司；QL902 涡旋振荡器，德国Dragon Lab 公司；SB-3200DTDN 超声波清洗器，宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 前处理方法

准确称取2.5 g 食用油样品（精确至0.01 g）于15 mL 离心管中，加入5 mL 乙腈/水/甲酸提取液（V乙腈∶V水∶V甲酸=80∶18∶2），涡旋振荡1 min，超声提取20 min，-20℃冷冻10 min，5 000 r/min 离心10 min，取上层清液全部转移至一洁净试管；向样品试管中加入5 mL 乙腈/水/甲酸提取液（V乙腈∶V水∶V甲酸=20∶78∶2），同上述步骤进行提取，合并2次提取液并混匀，待净化。

取5 mL 混合提取液加入Captiva EMR-Lipid净化柱，加正压使提取液流经净化柱速度为3 s/d，待提取液全部流出后，加入2 mL 乙腈/水（V乙腈∶V水=80∶20）溶液冲洗，收集全部净化后的提取液，在50℃水浴下，氮气吹干，加入250 μL 甲醇/水/甲酸溶液（V甲醇∶V水∶V甲酸=30∶70∶0.1）复溶，12 000 r/min 离心10 min，取上层清液待测。

1.3 仪器条件

1.3.1 色谱条件 色谱柱：Shiseido-C18（100 mm×2.0 mm，3 μm）；进样量20 μL；流速0.3 mL/min；流动相：A 相为0.1%甲酸/水溶液，B 相为0.1%甲酸/甲醇溶液；正模式洗脱梯度：0～1 min 30% B，6.5 min 55% B，8.5 min 55% B，10 min 80% B，12 min 80% B，12.01 min 30% B，16 min 30% B；负模式洗脱梯度为：0 min 3% B，2 min 55% B，9 min 70% B，10 min 99% B，11 min 99% B，11.1 min 3% B，15 min 3% B。

1.3.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI），离子源温度550℃；喷雾电压5 500 V（正模式）/-4 500 V（负模式）；气帘气2.4×105 Pa；气体1 3.8×105Pa；气体2 3.8×105Pa；采用多反应监测（MRM）模式进行检测，质谱参数见表1。

2 结果与讨论

2.1 真菌毒素的分离优化

本研究通过洗脱梯度优化结合串接质谱MRM 模式，可有效避免复杂基质对真菌毒素检测的干扰，并获得最优的分离效率。通过对离子化条件、离子对的筛选以及各毒素目标物的碎裂能和去簇电压进行优化（如表1所示），以期获得最优灵敏度。结合28 种真菌毒素目标物的结构性质差异，分别使用正、负电离模式，其MRM 谱图如图1和图2所示。

表1 28 种真菌毒素的质谱条件参数Table 1 MS/MS parameters of 28 mycotoxins

图1 28 种真菌毒素正模式MRM 色谱图Fig.1 MRM chromatograms of 28 mycotoxins of positive mode

图2 28 种真菌毒素混标的负模式MRM 色谱图Fig.2 MRM chromatograms of 28 mycotoxins of negative mode

2.2 方法学验证

2.2.1 方法的线性关系、检出限、定量限 取空白食用油样品，按照1.2 节中方法进行前处理，制备空白基质提取液。向空白基质提取液中加入适量的混合标准液配制标准工作液，按照1.3 节中的条件进行测定。以各毒素目标物的质量浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，绘制工作曲线。分别计算各毒素在3 倍信噪比和10 倍信噪比响应时对应的质量浓度，确定方法对于各目标物的检出限（LOD）和定量限（LOQ），结果见表2。从结果可以看出，各毒素目标物在其对应的质量浓度范围内线性关系良好。相关系数均大于0.999，线性范围满足风险监控的需求。

表2 28 种真菌毒素的线性范围、相关系数、检出限、定量限Table 2 Linear relationship，correlation coefficient，limit of detections（LODs）and limit of quantifications（LOQs）of 28 mycotoxins

（续表2）

2.2.2 方法回收率及精密度 为有效避免食用油基质对真菌毒素提取效率的影响，综合考虑28 种真菌毒素的极性差异，采用分步提取法，使用不同有机相比例的提取液进行提取。首先使用乙腈/水/甲酸（V乙腈∶V水∶V甲酸=80∶20∶0.1）对非极性目标化合物（如黄曲霉毒素等）进行提取。第2 步使用乙腈/水/甲酸（V乙腈∶V水∶V甲酸=20∶80∶0.1），对极性较大的化合物（如伏马毒素等）进行提取。合并提取液以提高各毒素目标物的提取效率。

图3对比了80%乙腈（2%甲酸）单一溶剂提取和分步提取方法对于伏马毒素回收率的影响。试验结果显示，分步提取法对伏马毒素回收率具有明显的提升。

图3 不同提取方法对于伏马毒素回收率的影响Fig.3 Effects of different extraction methods on fumarotoxin recovery

取空白样品提取液，进行三水平加标试验，每个含量水平平行测定6 次，计算6 次加标试验的平均回收率以及相对标准偏差（RSD），其结果见表3。本方法对于28 种真菌毒素的回收率在60%～120%之间，RSD 小于15%，符合国家标准GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》中对于方法回收率和精密度的要求。

表3 取空白样品提取液中28 种真菌毒素加标回收率及稳定性（n=6）Table 3 Spike recoveries and relative standard deviations of 28 mycotoxins in blank oils（n=6）

（续表3）

2.3 实际样品测定

应用本法，对市售的5 种常见食用油（玉米油、花生油、葵花籽油、大豆油、菜籽油）进行真菌毒素的风险筛查，结果如表4所示。筛查结果显示：虽然所测食用油样品存在黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、杂色曲霉素、α-玉米赤霉烯醇和玉米赤霉酮的污染，但是各真菌毒素含量范围均满足我国国家标准GB 2761-2017《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》中对于食用油中真菌毒素的限量要求。其次，花生油受污染的真菌毒素种类较多，包括黄曲霉毒素B1、B2和G1、杂色曲霉毒素以及玉米赤霉烯酮，玉米油受玉米赤霉烯酮污染的范围较大，应给予持续关注。

表4 常见食用油中真菌毒素的风险监测Table 4 Risk screening of 28 mycotoxins in common edible oil samples

（续表4）

3 结论

通过使用不同提取试剂的分步提取法，提高了28 种真菌毒素的提取效率。使用脂质净化柱净化提取液，去除了食用油基质中脂质类物质的干扰，各真菌毒素回收率在60%～120%范围。该样品净化方法可实现对食用油基质中多类真菌毒素的一步净化，相较于传统方法中使用免疫亲和柱和多功能净化柱，可较大程度地降低试验成本。样品经C18 色谱柱进行分离及外标法定量后，重复性、检出限、定量限和线性等指标均可满足GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》的要求。该方法具有高通量、低成本、高效率等优点，可应用于食用油中多中真菌毒素的快速风险筛查。