益生乳酸菌筛选及其对草石蚕汁发酵特性的影响

曾令州，周青青，顾 青，郦 萍

（浙江工商大学食品与生物工程学院 浙江省食品微生物技术研究重点实验室 杭州310018）

草石蚕又名螺丝菜、甘露子，是一种唇形科水苏属多年生草本植物。原产地是中国，主要分布于云南、四川、贵州、西北和华北等地。草石蚕营养价值丰富，富含蛋白质、多糖、多种矿物质和维生素，口感脆爽鲜嫩且无纤维，是腌制泡菜的上好食材[1-2]。传统的草石蚕腌制工艺是利用附着在草石蚕菜体上的乳酸菌等微生物，配合糖、醋等辅料进行自然发酵，这种腌制工艺虽然便捷，但是在腌制过程中会产生大量的亚硝酸盐或滋生大量杂菌，导致产品亚硝酸盐含量过高、霉变、腐败，威胁人体健康。

乳酸菌通常被认为是食品级微生物，由于能产生独特的风味和具有抗菌作用而广泛应用于发酵食品中，其中利用乳酸菌制作泡菜类食品最为常见[3-5]。研究表明，乳酸菌在发酵过程中能有效降解亚硝酸盐[6-7]，抑制泡菜中杂菌生长[8-9]；同时，乳酸菌发酵还能产生维生素[10-12]、多糖等营养成分[13]，提高泡菜产品的营养附加值。吴映明等[14]研究发现人工接种乳酸菌腌制甘蓝泡菜，能有效降低甘蓝泡菜的亚硝酸盐水平。吴海清等[15]采用直投式乳酸菌粉腌制卫青萝卜泡菜能缩短发酵周期。目前，国内外利用乳酸菌发酵草石蚕泡菜的研究鲜有报道。

本研究旨在筛选优质益生乳酸菌，并将其接种至草石蚕菜汁培养基发酵，模拟人工接种乳酸菌发酵草石蚕腌制泡菜。通过分析其发酵草石蚕菜汁时的生长特性、产酸特性、抑菌特性、B 族维生素含量等指标，探究乳酸菌对草石蚕泡菜的影响。

1 材料与设备

1.1 菌种来源

本研究所用到的菌株如表1所示。

1.2 主要试剂和药品

亚硝酸钠、亚铁氰化钾、四硼酸钠、乙酸锌、盐酸萘乙二胺、对氨基苯磺酸购于国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠、琼脂粉、氯化钠、硫酸锰、牛肉浸膏、七水硫酸镁、柠檬酸二氢钾、吐温-80、无水乙酸钠、磷酸氢二钾、无水葡萄糖、酵母提取物、蛋白胨、琼脂粉购于永华化学科技（江苏）有限公司。

1.3 培养基和缓冲液

1）MRS 液体培养基 蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、无水葡萄糖20 g/L、牛肉膏10 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、乙酸钠5 g/L、七水硫酸镁0.2 g/L、硫酸锰0.05 g/L、吐温80 1 mL/L，121℃灭菌15 min。固体培养基在液体培养基的基础上添加2%的琼脂。

2）叶酸测定培养基（FACM）FACM 干粉配置成96.9 g/L 的溶液，121℃灭菌15 min。

3）LB 半固培养基 胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化钠10 g/L、琼脂粉1.2%，调节pH值至7.0，121℃灭菌15 min。

4）叶酸缓冲液 磷酸二氢钾0.1 mol/L、磷酸氢二钾0.1 mol/L、抗坏血酸0.1 g/L，调节pH 值至6.8，现配现用。

1.4 仪器和设备

pH 酸度计（PB-10）、电子天平（PL203），梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；涡旋振荡器（SW-2FD），上海医科大学科学仪器厂；生物安全柜、小型离心机，美国Thermo 公司；生化培养箱（SPX-150B-Z 型），上海博讯实业有限公司医疗设备厂；尤尼柯2000 可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；全自动灭菌锅，美国Tuttnauer公司；恒温水浴锅（DK-8D），上海精宏实验设备有限公司；冷冻干燥机，德国Christ 公司；酶标仪（SpectraMax 190），美谷分子仪器（上海）有限公司。

1.5 试验方法

1.5.1 草石蚕菜汁培养基的制备 将新鲜草石蚕洗净后清水浸泡2 h，按料液比1∶1 的比例加水榨汁。菜汁用双层纱布过滤2 次后离心20 min（4℃，10 000 r/min）。取上清液加入2%的葡萄糖和2%氯化钠，121℃灭菌15 min 后备用[16]。

1.5.2 益生乳酸菌的筛选

1.5.2.1 菌株的活化 菌种活化：将-80℃保藏的菌种用划线的方法活化。将乳酸菌、指示菌划线于适宜的固体培养基中培养（见表1）。挑取单菌落于相应液体培养基培养过夜。

表1 试验菌株Table 1 Strains of experiments

1.5.2.2 优势菌的筛选 选自实验室菌种保藏库中的10 株乳酸菌经活化后，按3%的接种量接至草石蚕菜汁培养基中，37℃培养24 h 后用紫外-分光光度计测定菌液OD600nm值。按OD600nm 值的大小选取生长情况良好的菌株进行后续试验。

1.5.2.3 接种量的确定 将初筛获得的植物乳杆菌ZJ316、副干酪乳杆菌ZFM54、沙克乳杆菌ZFM225 经活化后，按1%，2%，3%，4%，5%的接种量接至草石蚕菜汁培养基，37℃培养24 h，利用平板涂布法测定草石蚕菜汁发酵液中的活菌数。

1.5.2.4 菌株生长曲线和产酸量的测定 将植物乳杆菌ZJ316、副干酪乳杆菌ZFM54、沙克乳杆菌ZFM225 活化后，按3%的接种量接入草石蚕培养基，每隔4 h 用紫外-分光光度计测定菌液的OD600nm值、pH 值和可滴定酸浓度。用0.05 mol/L 的NaOH 溶液进行酸碱滴定，并以酚酞溶液为指示剂指示滴定终点，可滴定酸度按式（1）计算：

式中，a——总酸度，%；NNAOH——NaOH 溶液的浓度，mol/L；VNaOH——NaOH 溶液滴定体积，mL；V样品——样品体积，mL。

1.5.2.5 亚硝酸盐降解试验 将活化的植物干杆菌ZJ316、副干酪乳杆菌ZFM54、沙克乳杆菌ZFM225 按3%的接种量接至含1% NaNO2 的草石蚕菜汁培养基中，37℃培养48 h，每6 h 取样。参照国标GB 5009.33-2016《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中的盐酸萘乙二胺法绘制标准曲线，并测定亚硝酸盐含量，计算结果用降解率表示[17]。

1.5.2.6 抑菌试验 利用牛津杯抑菌圈法测定植物乳杆菌ZJ316、副干酪乳杆菌ZFM54、沙克乳杆菌ZFM225 的抑菌性质。将活化后的3 株乳酸菌，按3%的接种量接至草石蚕菜汁培养基，于37℃培养24 h。草石蚕发酵液于8 000 r/min 离心5 min（4℃），取上清液备用。将抑菌试验所需的指示菌在合适的培养条件下培养，按1%的接种量接入50℃左右融化的半固培养基中，混合均匀后倒入牛津杯的平板上，待完全冷却后拔出牛津杯。用移液枪吸取150 μL 发酵上清液加入孔洞中，37℃培养12 h 后用游标卡尺测量抑菌圈大小。

1.5.2.7 产叶酸能力测定利用德国拜发IFP 维生素B9叶酸微生物法试剂盒对发酵样品中的叶酸含量进行测定。按试剂盒中说明书要求对样品进行处理，将处理后的样品与培养基加入试剂盒自带的微孔板中，用粘合箔封紧后于37℃黑暗条件下培养48 h。培养完成后从培养箱中取出微孔板，再次压紧粘合膜并在桌面上震荡，使微生物在培养基中混合均匀。随后轻轻撕下粘合膜，破坏微孔中的所有泡沫，并用酶标仪在波长540 nm 处测定微孔的OD540nm值。

1.5.2.8 菌株发酵草石蚕菜汁产生的挥发性风味物质的测定

1）样品处理 将活化后的植物乳杆菌ZJ316、沙克乳杆菌ZFM225、副干酪乳杆菌ZFM54按3%的接种量接种于草石蚕菜汁培养基中，37℃培养24 h 后取10 mL 装入15 mL 顶空进样瓶中，将顶空进样瓶放到50℃水浴锅内加热30 min，备用。

2）顶空固相微萃取条件 将老化后的萃取头插入进样瓶顶空部分，50℃平衡30 min、吸附30 min 后，将萃取头取出并插GC 进样口，同时启动仪器采集数据，解吸20 min。

3）GC-MS 条件7890A/5975 GC/MS 联用仪；色谱柱：HP-5MS 型（30 m×0.250 mm×0.25 μm）；载气：氦气；进样温度：230℃；进样量：1 μL；升温程序：初温45℃保持2 min，以5℃/min速率上升至180℃，保持1 min 后以25℃/min 速率升到230℃，保持5.5 min。

4）数据处理 由计算机质谱系统NSIT 检索未知化合物，匹配度大于70%的结果将予以报告，采用面积归一法计算各成分的含量。

1.6 数据分析

上述所有试验均重复3 次。所有数据均表示为平均值±标准偏差。数据分析使用Origin 9.0（OriginLab，USA）处理。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的初步筛选

乳酸菌在草石蚕菜汁培养基中的生长情况，不仅能够反映出乳酸菌对草石蚕菜汁发酵环境的适应能力，也是乳酸菌发酵性能分析的基础，因此本研究通过生长情况测定初步筛选出优质乳酸菌菌株。如图1所示，培养24 h 后，植物乳杆菌ZJ316、副干酪乳杆菌ZFM54、沙克乳杆菌ZFM225在草石蚕菜汁培养基中生长情况最好，OD600nm值分别为1.84，1.64，1.58，本研究选择这3 株乳酸菌进行后续试验。

图1 乳酸菌在草石蚕菜汁培养基中的生长情况Fig.1 Situation about lactic acid bacteria growing on Stachys sieboldii Miq juice medium

2.2 发酵性能的测定

2.2.1 最佳接种量的确定 接种量的多少与乳酸菌在培养基中生长情况密切相关，过小的接种量会导致乳酸菌生长密度偏低，而接种量过高则会出现营养匮乏导致菌体死亡的现象，因此确定一个最优的接种量非常重要。如图2所示，植物乳杆菌ZJ316 在3%接种量处有最高活菌数8.7×108CFU/mL、沙克乳杆菌ZFM225 在3%接种量处有最高活菌数1.7×108CFU/mL、副干酪乳杆菌ZFM54 在3%接种量处有最高活菌数2.3×108CFU/mL。因此，植物乳杆菌ZJ316、沙克乳杆菌ZFM225、副干酪乳杆菌ZFM54 的最佳接种量均为3%。

图2 接种量对乳酸菌生长情况的影响Fig.2 Effects of inoculation on growth of lactic acid bacteria

2.2.2 生长特性如图3所示，本次研究筛选出的3 株益生功能型乳酸菌ZJ316、ZFM225、ZFM54均能很好的适应草石蚕菜汁培养基的发酵环境，这3 株乳酸菌均在培养8 h 达到指数生长期，16 h 达到平稳期。其中以植物乳杆菌ZJ316 的生长情况最为良好，培养24 h 后OD600nm 值可达到1.824。

图3 乳酸菌在草石蚕菜汁培养基上的生长曲线Fig.3 Lactic acid bacteria growth curve on Stachys sieboldii Miq juice medium

2.2.3 产酸特性 乳酸菌在发酵草石蚕等蔬菜的过程中会通过代谢生成乙酸、丁酸和乳酸等有机酸，使发酵体系pH 值下降，同时给泡菜产品带来特殊风味。如图4和图5所示，植物乳杆菌ZJ316、沙克乳杆菌ZFM225、副干酪乳杆菌ZFM54 在草石蚕菜汁培养基中都有一定的产酸能力，其中以植物乳杆菌ZJ316 的产酸能力最强，培养24 h 后使环境pH 值降到4.18，酸度达到0.45%。

图4 乳酸菌在草石蚕菜汁培养基上pH 值的变化Fig.4 Changes of pH of lactic acid bacteria in Stachys sieboldii Miq juice medium

图5 乳酸菌在草石蚕菜汁培养基上酸度的变化Fig.5 Changes of acidity of lactic acid bacteria in Stachys sieboldii Miq juice medium

2.3 降解亚硝酸盐活性

研究表明，腌制食品在发酵过程中会产生大量亚硝酸盐，这些亚硝酸盐会与人体内仲胺类物质发生化学反应生成强致癌物亚硝胺，严重威胁人体健康。乳酸菌在发酵过程中能够显著地降低体系内亚硝酸盐水平。

将亚硝酸钠精确地配置成0.1，0.2，0.5，1.0，2.0 mg/L 的标准溶液，按要求绘制标准曲线并根据标准曲线计算样品测定结果。如图6所示，3 株益生乳酸菌ZJ316、ZFM225、ZFM54 在草石蚕菜汁培养基中都对亚硝酸盐有一定的降解效果，其中以植物乳杆菌ZJ316 的降解活性最强，其亚硝酸盐降解率达82.83%。

图6 乳酸菌对亚硝酸盐降解率的影响Fig.6 Effects of lactic acid bacteria for nitrite degradation

2.4 抑菌活性

乳酸菌在草石蚕菜汁培养基中发酵的过程会代谢出大量的有机酸导致环境pH 值下降，酸性环境会抑制部分杂菌生长；同时乳酸菌发酵过程中还会产生特有的细菌素，也能抑制部分有害菌的生长，这对保证乳酸菌发酵蔬菜产品的健康安全起到至关重要的作用。表2为3 株益生乳酸菌发酵上清液的抑菌试验结果，可以看出植物乳杆菌ZJ316 对所选指示菌均有较好的抑制效果，而沙克乳杆菌ZFM225 和副干酪乳杆菌ZFM54只对部分指示菌有一定抑菌作用。

表2 抑菌圈直径Table 2 Diameter of inhibition zone

2.5 产叶酸能力

2.5.1 叶酸标准曲线 按试剂盒说明书要求配置叶酸标品（如表3所示），按照对应质量浓度梯度作出标准曲线：y=0.7536x-0.0003（R2=0.9813），曲线线性较为良好，可以用来分析样品叶酸的质量浓度。

表3 叶酸标品质量浓度表Table 3 Mass concentration of folic acid standard

图7 叶酸标准曲线Fig.7 Standard curve of folic acid

2.5.2 叶酸含量测定 取出微孔板后，用酶标仪在指定区域读出校准标品OD540nm值，并用试剂盒自带分析软件RIDARSOFT Win 分析得到校准标品质量浓度为0.99 μg/100 mL（原质量浓度为1.00 μg/100 mL），则检测结果精确度为98.70%。之后用酶标仪在指定区域读出样品的OD540nm值，并经分析软件RIDA®SOFT Win 分析得到3 株乳酸菌株产叶酸情况。结果显示，3 株乳酸菌均有一定的产叶酸能力，培养48 h 后植物乳杆菌ZJ316、沙克乳杆菌ZFM225 和副干酪乳杆菌ZFM54 的平均OD540nm分别为0.942，0.474，0.640。根据标准曲线公式y=0.7536x-0.0003，换算得到相应的叶酸产量：植物乳杆菌ZJ316 叶酸产量为1.25 μg/100 mL，产量最高；沙克乳杆菌ZFM225 叶酸产量为0.63 μg/100 mL；副干酪乳杆菌ZFM54 叶酸产量为0.85 μg/100 mL。

2.6 草石蚕汁发酵所产挥发性风味物质测定

经顶空固相微萃取后进行GC-MS 分析，得到挥发性风味物质的相对含量。从表4中可以看出，共检测出54 种物质，其中醇类20 种、酯类5 种、酸类10 种、醛类5 种、酮类11 种、烷类2 种、其它类物质2 种。3 组中相对含量均较高的物质有异戊酸、乙酸、3-羟基-丁酮（乙偶姻）和2-壬酮。这些物质应为草石蚕泡菜的主要风味成分。植物乳杆菌ZJ316 组共检出41 种物质，其中醇类15 种、酯类3 种、酸类7 种、醛类3 种、酮类9 种、烷类1种、其它类物质2 种；沙克乳杆菌ZFM225 组共检出19 种物质，其中醇类5 种、酯类2 种、酸类2种、醛类3 种、烷类2 种、酮类5 种；副干酪乳杆菌ZFM54 组共检出38 种物质，其中醇类14 种，酸类9 种、酯类3 种、酮类8 种、醛类2 种、烷类1 种、其它1 种。可以看出，植物乳杆菌ZJ316 组在风味物质方面明显优于沙克乳杆菌ZFM225 组，略优于副干酪乳杆菌ZFM54 组，使用植物乳杆菌ZJ316 发酵草石蚕可以赋予泡菜更好的发酵风味。

表4 草石蚕汁挥发性风味物质成分表Table 4 Volatile flavor components of Stachys sieboldii Miq juice medium

（续表4）

3 结论

传统的草石蚕腌制工艺采取自然发酵的方式，该工艺生产的泡菜产品亚硝酸盐含量高、易被杂菌污染等弊端明显，而人工接种乳酸菌生产泡菜产品可以很好地避免和解决这类问题。本试验将新鲜的草石蚕洗净榨汁加入2% NaCl 和葡萄糖制成草石蚕菜汁培养基并接入乳酸菌来模拟乳酸菌发酵草石蚕的实际情况。从课题组保藏的乳酸菌中筛选出3 株（植物乳杆菌ZJ316、沙克乳杆菌ZFM225、副干酪乳杆菌ZFM54）在草石蚕菜汁培养基中的生长情况良好菌株，培养24 h 后其OD600nm分别为1.84，1.58，1.64。进一步研究发现，在3 株菌中植物乳杆菌ZJ316 产酸能力最强，培养24 h 后使环境pH 降到4.18，酸度达到0.45%；降解亚硝酸盐能力最强，培养48 h 后降解率可达到82.83%；产叶酸能力最强，培养48 h 后其叶酸含量可达12.5 μg/L；抑菌活性最强，其发酵上清对10 株指示菌均有不错的抑制效果。GC-MS 分析表明，植物乳杆菌ZJ316 发酵能产出酸类、醇类、酮类等物质，赋予草石蚕泡菜产品优良的发酵风味。植物乳杆菌ZJ316 的上述特性，可应用于草石蚕泡菜发酵，改善泡菜风味，提高产品附加值，为开发绿色、营养、健康的草石蚕泡菜产品及实现产品的升级换代奠定了理论基础。