牡蛎肽对TM3细胞性功能的影响

方 磊，张瑞雪，陈 亮，张海欣，贾福怀，晏永球，谷瑞增，魏 颖*

（1 中国食品发酵工业研究院 北京市蛋白功能肽工程技术研究中心 北京100015 2 宁波御坊堂生物科技有限公司 浙江宁波315012）

随着生活水平的提高，男性生殖健康的问题也越来越引起人们的关注[1]。牡蛎属于软体动物门、瓣鳃纲、异柱目、牡蛎科，是世界第一大养殖贝类，也是我国四大养殖贝类之一。研究发现，牡蛎不仅含有丰富的糖原、蛋白质、人体必需的8 种氨基酸以及维生素，还富含锌、硒、铁、铜、碘等微量元素，尤其是含有丰富的牛磺酸[2-3]。《本草纲目》记载：牡蛎肉“多食之，能细括皮肤，补肾壮阳，并能治虚，解丹毒”。牡蛎中含有非常丰富的锌元素和精氨酸，锌元素能够维持男性生殖健康，而且还能有效改善前列腺肥大等男性疾病；精氨酸是精子合成的必需成分，常吃富含精氨酸的食品有助于补肾益精。食源性低聚肽是目前研究的热点方向，而牡蛎肽就是其中最为重要的一种。牡蛎肽的生产技术成熟，且其分子质量、氨基酸等成分明确。目前关于牡蛎促进男性性功能方面的研究内容较少。本文以牡蛎全粉、牡蛎肽为研究对象，体外培养小鼠睾丸间质细胞（TM3），研究其对TM3 细胞合成和分泌睾酮、二氢睾酮、NO、SOD 酶活及cGMP 等影响，为开发利用牡蛎奠定基础，也为其应用于相应保健食品提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

正常小鼠睾丸间质细胞（TM3 细胞），中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心；DMEM/F12（1∶1）培养基，美国GIBCO 公司；胎牛血清，杭州四季青公司；NO 测定试剂盒、SOD 测定试剂盒、睾酮测定试剂盒、二氢睾酮测定试剂盒、cGMP 测定试剂盒，美国Enzo 公司；西地那非，美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

BX53 型倒置显微镜，日本奥林巴斯公司；细胞培养箱，美国Thermo 公司；SpectraMaxR iD5 型多功能酶标仪，美国Molecular Devices 公司；Accuri C6 型流式细胞仪，美国BD 生物科学仪器及软件公司；L-8900日立全自动氨基酸分析仪，天美（中国）科学仪器有限公司；3K-15 型冷冻离心机，德国Sigma 公司。

1.3 试验方法

1.3.1 牡蛎全粉、牡蛎肽的制备

1）牡蛎全粉的制备 牡蛎全粉按以下工艺流程制备：牡蛎肉-匀浆-酶解-陶瓷膜过滤-浓缩-活性炭过滤-喷雾干燥-牡蛎全粉。

2）牡蛎肽的制备 牡蛎肽按以下工艺流程制备：牡蛎肉-匀浆-水洗-酶解-陶瓷膜过滤-浓缩-活性炭过滤-喷雾干燥-牡蛎肽。

1.3.2 氨基酸组成分析 依据GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的测定》[4]方法，采用L-8900日立全自动氨基酸分析仪对牡蛎全粉、牡蛎肽中的氨基酸组成进行测定。

1.3.3 分子质量分布测定 将样品用流动相溶解后并经孔径0.2 μm 聚四氟乙烯过滤膜过滤，然后通过高效液相色谱仪进行测定，根据标准曲线得到样品的分子质量分布。

1.3.4 TM3 细胞培养 使用含有5% HS、2.5%FBS 的DMEM/F12（1∶1）培养基，在37℃，5% CO2及充分饱和湿度的培养箱中培养TM3 细胞。根据细胞的实际情况，2～3 d 换一次培养液，待细胞培养至培养皿的80%左右时，弃掉培养瓶中旧培养基，用PBS 缓冲液冲洗细胞2～3 次，加入适量室温复温的0.05%胰酶消化液，按照1∶3 传代培养。3 次传代后取处于对数期、生长状态良好的细胞用于试验。

1.3.5 试验分组 将培养的细胞随机分为正常对照组、阳性对照组、牡蛎全粉试验组及牡蛎肽试验组，其中试验组作用质量浓度分别为0.1，0.2，0.4，0.8，1，2，4，8，10 mg/mL。在保证牡蛎肽总量一定的情况下，为考察不同加样时间对TM3 细胞的影响，又将0.4 mg 牡蛎全粉或牡蛎肽分2 次加样（每12 h 加1 次）即每次添加0.2 mg。

1.3.6 MTT 法检测细胞存活率按1.3.4 节方法消化后将细胞密度稀释为1×105 个/mL，将细胞加入96 孔板中（100 μL/孔）。24 h 观察到细胞均匀贴壁后，弃掉上清液，加入PBS 缓冲液冲洗细胞2～3 次，分别用含有不同质量浓度牡蛎肽或牡蛎全粉的培养液处理细胞，不加样品的孔设为正常对照组，同一块96 孔板，每个质量浓度梯度设置4 复孔，24 h 后弃细胞上清液，再用PBS 缓冲液冲洗细胞2～3 次，然后每孔加入100 μL MTT 溶液（0.5 mg/mL），37℃继续孵育4 h，小心去除培养液及MTT，每孔加入100 μL DMSO 溶液，震荡10 min 使结晶物溶解。用酶标仪在波长490 nm 处测定吸光值。细胞存活率（%）=OD 试验组/OD对照组×100。

1.3.7 检测指标与方法 取细胞培养上清作为样本，NO、睾酮、二氢睾酮、cGMP 含量参照美国Enzo 公司提供的试剂盒说明书对其进行定量；SOD活性参照美国Enzo 公司提供的试剂盒说明书对其进行测定。

1.3.8 统计学处理试验数据采用Origin 8.0 软件进行统计学处理，采用单因素方差分析和t 检验，P＜0.05，证明数据差异具有显著性。

2 结果与分析

2.1 牡蛎肽的氨基酸组成

牡蛎全粉、牡蛎肽的氨基酸组成和含量见表1和2。牡蛎全粉、牡蛎肽的氨基酸总量分别为42.669%和54.977%，其中牡蛎全粉、牡蛎肽中均含有人体必需的7 种氨基酸（不含色氨酸）和2 种半必需氨基酸（组氨酸和精氨酸），牡蛎肽的氨基酸含量要高于牡蛎全粉，其精氨酸含量是牡蛎全粉的6.64 倍，精氨酸是精子形成的重要因素，常吃富含精氨酸的食品有助于补肾益精。牡蛎肽含有多种氨基酸且含量丰富，具有很高的营养价值，是人体补充必需氨基酸的重要来源。

表1 牡蛎全粉的氨基酸含量Table 1 Amino acid content of oyster whole powder

表2 牡蛎肽的氨基酸含量Table 2 The amino acid content of oyster peptide

2.2 牡蛎全粉、牡蛎肽的分子质量分布

牡蛎全粉、牡蛎肽的分子质量分布通过高效液相凝胶色谱测定，得到分子质量分布凝胶色谱图和分子质量分布情况，见图1和表3。牡蛎全粉和牡蛎肽的分子质量主要集中在1 000 u 以下，其含量分别高达86.6146%和92.1264%，而牡蛎肽小于1 000 u 的占比要高于牡蛎全粉的占比，说明牡蛎肽中含有更多的小分子肽混合物。研究表明肽的吸收速率与其相对分子质量有关，相对分子质量小于1 000 u 的大多数是二肽、三肽等[5]，因二肽、三肽的转运吸收存在独立的系统以及相应的载体，所以肽比蛋白质和游离氨基酸的吸收效率快，消耗能量低，可以推断出牡蛎肽具有良好的吸收效率。

图1 牡蛎全粉和牡蛎肽凝胶色谱图Fig.1 Gel chromatogram of oyster powder and oyster peptide

表3 牡蛎全粉和牡蛎肽分子质量分布Table 3 Molecular distribution of oyster whole powder and oyster peptide

2.3 牡蛎全粉、牡蛎肽对TM3 细胞存活率的影响

为检测不同质量浓度的牡蛎全粉及牡蛎肽对TM3 细胞活性的影响，设置系列质量浓度为0.1，0.2，0.4，0.8，1，2，4，8，10 mg/mL 的样品作用于TM3 细胞，并通过MTT 法确定样品的最适作用质量浓度。由图2可知，与未加入样品的对照组相比，当牡蛎全粉质量浓度在0.1～1 mg/mL 范围时对TM3 细胞的存活率无显著影响（P＞0.05）；当牡蛎全粉质浓度在2～10 mg/mL 范围内时对细胞的活性具有抑制作用，且具有浓度依赖性。牡蛎肽对TM3 细胞活性的影响与牡蛎全粉呈相同趋势，为了保证后续试验细胞的正常生长，样品的加样质量浓度应在无毒性质量浓度以下。因此，选取牡蛎全粉、牡蛎肽的加样质量浓度为0.1，0.4，1 mg/mL。

图2 牡蛎全粉和牡蛎肽对细胞存活率的影响Fig.2 Effects of oyster whole powder and oyster peptide on cell survival rate

2.4 牡蛎全粉、牡蛎肽对TM3 细胞睾酮分泌的影响

用不同质量浓度的牡蛎全粉、牡蛎肽处理TM3 细胞24 h 后，收集细胞的上清培养基用ELISA 法检测细胞分泌的睾酮含量。与对照组相比，牡蛎全粉、牡蛎肽处理显著增加TM3 细胞的睾酮分泌量（P＜0.05），具有浓度依赖性，而且牡蛎肽对TM3 细胞睾酮分泌的促进作用要高于牡蛎全粉，可能是因为牡蛎肽含有更多的小分子混合肽，利于细胞的吸收利用，使得细胞睾酮分泌量更高。此外，当牡蛎肽质浓度为1 mg/mL 时，对TM3细胞分泌睾酮的促进作用要高于阳性对照西地那非（0.2 mg/mL），表明牡蛎肽确实具有促进TM3 细胞分泌睾酮的作用。

2.5 牡蛎全粉、牡蛎肽对TM3 胞分泌二氢睾酮的影响

如图4所示，对照组TM3 细胞的二氢睾酮含量明显低于经牡蛎全粉、牡蛎肽处理的TM3 细胞二氢睾酮含量（P＜0.05），且相同质量浓度的牡蛎肽对TM3 细胞分泌二氢睾酮的促进作用要高于牡蛎全粉。与对照组相比，牡蛎肽终质量浓度为1 mg/mL 时，TM3 细胞中睾酮的含量升高了近5 倍，与阳性对照西地那非（0.2 mg/mL）对TM3 细胞的促进作用相近，表明牡蛎肽能够促进和改善睾丸间质细胞分泌二氢睾酮。二氢睾酮是由睾酮与体内的5α还原酶发生反应后生成的一种雄性激素，2.4 节已经表明牡蛎肽能够显著增强TM3 细胞中睾酮的含量，该结果与上述结果趋势相一致。

2.6 牡蛎全粉、牡蛎肽对TM3 细胞NO 含量的影响

NO 是一种脂溶性小分子，其化学性质不稳定，体内在一氧化氮合酶的催化反应下产生，在体内可以引起血管的扩张[6]。由图5可知，与对照组TM3 细胞比较，阳性西地那非组、牡蛎全粉、牡蛎肽组TM3 细胞NO 含量均显著地增加（P＜0.05），且牡蛎肽的促进作用要高于牡蛎全粉。

2.7 牡蛎全粉、牡蛎肽对TM3 细胞cGMP 含量的影响

TM3 细胞cGMP 含量通过直接ELISA 法测定，并以西地那非作为阳性对照。从图6可知，与空白对照相比，牡蛎全粉、牡蛎肽能显著提高TM3细胞cGMP 的含量，并且随质量浓度的增加其作用效果越强，尤其是牡蛎肽对TM3 细胞的促进作用最为明显。

2.8 牡蛎肽对TM3 细胞SOD 酶活力的影响

为评价TM3 细胞氧化环境，牡蛎全粉、牡蛎肽作用TM3 细胞24 h 后，对TM3 细胞SOD 酶活力进行了测定。由图7可知，样品组细胞内SOD酶活力与对照组相比显著提高（P＜0.05），高剂量组（1 mg/mL）效果要明显优于低剂量组（0.1 mg/mL），呈现一定的剂量依赖性，而且牡蛎肽增强酶活的效果要好于牡蛎全粉。牡蛎肽处理TM3细胞后，可以显著增强SOD 的酶活力，使细胞内的氧化环境有助于睾酮、二氢睾酮等雄性激素的生成。

图3 牡蛎全粉和牡蛎肽对TM3 细胞睾酮分泌量的影响Fig.3 Effects of oyster whole powder and oyster peptide on testosterone secretion in TM3 cells

图4 牡蛎全粉、牡蛎肽对TM3 细胞二氢睾酮分泌量的影响Fig.4 Effects of oyster whole powder and oyster peptide on the secretion of dihydrotestosterone in TM3 cells

图5 牡蛎全粉、牡蛎肽对TM3 细胞NO 含量的影响Fig.5 Effects of oyster whole powder and oyster peptide on NO content in TM3 cells

图6 牡蛎全粉、牡蛎肽对TM3 细胞cGMP 含量的影响Fig.6 Effects of oyster whole powder and oyster peptide on cGMP content in TM3 cells

2.9 不同加样时间对TM3 细胞活性的影响

综上可知，牡蛎肽对TM3 细胞的促进作用要高于牡蛎全粉。在保证加样总量相等的情况下，进一步考察不同的加样时间对TM3 细胞活性的影响，牡蛎肽质量浓度为0.4 mg/mL 时在24 h 加样1 次与浓度为0.2 mg/mL 时在24 h 内加样2 次均能显著提高TM3 细胞内的睾酮、二氢睾酮、NO、cGMP 含量，显著增强TM3 细胞SOD 酶活力，然而等量的牡蛎肽，24 h 内加样2 次对TM3细胞活性的影响要比加样1 次更加显著，可能是因为2 次加样更有利于TM3 细胞吸收利用牡蛎肽，所以TM3 细胞分泌的雄性激素较多，SOD 酶活力更高。

图7 牡蛎全粉、牡蛎肽对TM3 细胞SOD 酶活力的影响Fig.7 Effects of oyster whole powder and oyster peptide on SOD activity of TM3 cells

图8 牡蛎肽对TM3 细胞活性的影响Fig.8 Effects of oyster peptide on the activity of TM3 cells

牡蛎肽是经酶解后得到的二肽或三肽混合物，其分子质量一般在1 000 u 以下。据报道，蛋白质经酶解后形成的二肽和三肽在体内可以不经消化[7]，直接被人体吸收，具有很高的营养价值和生理功能[8]。牡蛎肽的酶解过程温和，条件易于控制，其氨基酸组成丰富尤其是精氨酸含量较高，食用安全性很高，没有任何副作用，可作为食品保健品的原料。NO 作为体内重要的神经介质，可进一步激活鸟苷酸环化酶，提高cGMP 水平，降低Ca2+含量，最后导致平滑肌松弛诱导阴茎勃起。研究中发现牡蛎肽可以显著地提高睾丸间质细胞内的NO含量，这对改善性功能缺陷有很重要的意义[9]。已有研究表明，玛咖能够改善大鼠睾丸细胞的NOcGMP 通路，提高大鼠性功能[10]。试验表明牡蛎肽与阳性对照西地那非对TM3 细胞提高cGMP 含量的效果相近，牡蛎肽也能通过改善NO-cGMP通路，提高TM3 细胞cGMP 的含量。

正常机体细胞内ROS 的产生和清除处于动态平衡，细胞内的氧化环境对睾丸细胞分泌雄激素（睾酮）至关重要。SOD 是体内重要的抗氧化酶，能清除氧自由基，减轻组织细胞的过氧化损伤，对于维持机体细胞内的氧化和抗氧化平衡非常重要。据研究报道，大多数氨基酸都具有抗氧化活性，如赖氨酸、亮氨酸、精氨酸、脯氨酸、丙氨酸等，其肽的抗氧化特性与其氨基酸的组成和含量有直接的关系[11]。牡蛎全粉和牡蛎肽中的赖氨酸、亮氨酸、精氨酸含量较高，因此具有抗氧化特性，能够显著增强TM3 细胞的SOD 酶活性，提供良好的氧化环境，利于雄激素睾酮和二氢睾酮的分泌。

3 结论

本研究首先对牡蛎全粉和牡蛎肽的氨基酸组成及分子质量分布进行了分析，并对两者对雄激素合成的影响进行了研究。结果表明：牡蛎肽较牡蛎全粉含有更丰富的精氨酸，而精氨酸是男性精子合成的必需成分。牡蛎肽较牡蛎全粉含有更多相对分子质量低于1 000 u 的小分子肽；牡蛎肽比牡蛎全粉更显著地促进TM3 细胞分泌睾酮、二氢睾酮、cGMP，增加TM3 细胞NO 含量和SOD 酶活力。此外，等量的牡蛎肽在24 h 加样2 次要比加样1 次时对TM3 细胞活性的影响更大。本研究为牡蛎肽开发功能性食品提供了一定的理论支持。