薏苡仁酯对人成骨肉瘤MG-63细胞增殖和凋亡的影响*

张菁菁 张久亮 李左安

(1华中农业大学食品科学与技术学院 湖北武汉 430070；2福建省立医院急诊科，福建医科大学省立临床医学院，福建省急诊医学重点实验室 福建福州 350001)

骨肉瘤是最常见的原发性骨恶性肿瘤，恶性度高，容易早期转移，死亡率高，一直是骨科领域难以攻克的难题。目前手术切除联合化疗治疗方案，骨肉瘤患者存活率虽有所提高，但长期存活率较低；然而不可切除、原发性或者复发性骨肉瘤，预后较差[1]。因此寻找一种更为有效的药物或者治疗手段迫在眉睫。在众多治疗手段中，诱导肿瘤细胞凋亡是一种新的行之有效的方法。细胞凋亡是细胞在各种死亡信号刺激后发生的一系列瀑布式激活的主动性细胞死亡过程[2]。研究发现许多药物通过诱导肿瘤细胞凋亡进行抗肿瘤治疗[3-6]。近年来，通过对细胞凋亡及其机制的深入研究证实，肿瘤的发生、发展及产生耐药性与细胞凋亡有着密切的关系。细胞凋亡的减少可引起肿瘤的发生，且通过逃避凋亡而促进肿瘤细胞的恶性转化及演进。特异性诱导肿瘤细胞凋亡已成为肿瘤治疗研究的热门领域[7]，也成为评价肿瘤治疗效果的标志，为研究有效治疗肿瘤的方法提供可靠的依据。

薏苡为禾本科薏苡属草本植物，其干燥成熟的种仁被称为薏苡仁，是一种药食两用中药[8]。现代药理学表明，薏苡仁具有抗肿瘤、提高免疫力等作用，主要活性成分为薏苡仁酯[9]。薏苡仁酯抗肿瘤作用的研究由来已久，1961年，日本学者首次发现荷瘤小鼠腹腔注射薏苡仁乙醇提取物能抑制艾氏腹水癌细胞的增殖，证实薏苡仁丙酮提取物显著抑制子宫颈癌14及腹水型肝细胞，并认为薏苡仁酯是其抗癌活性成分[10]。李大鹏从1975年起研究从薏苡仁中提取抗癌活性成分，研制出“康莱特注射液”，从此掀开了薏苡仁抗肿瘤的研究热潮，并认为康莱特抗癌的主要活性成分是薏苡仁酯[11]。研究表明薏苡仁酯能有效抑制鼻咽癌CNE-2R和CNE-2细胞[12]、人早幼粒白血病HL-60细胞[13]、结肠癌SW480细胞[14]、人宫颈癌HeLa细胞[15]、人肝癌BEL-7404细胞[16]、人乳腺癌MCF-7细胞[17]、人肺腺癌细胞A594细胞[18]等增殖。因此，文章探究薏苡仁酯对人成骨肉瘤MG-63细胞增殖、凋亡的影响，以期为骨肉瘤更好的治疗提供全新的思路。

1材料与方法

1.1材料

人成骨肉瘤MG-63细胞购自ATCC细胞库，DMEM培养基购买自Hyclone公司(美国)，胎牛血清购自浙江天航生物技术公司，青霉素/链霉素购自吉诺生物化学公司，磷酸盐缓冲液(PBS)，以及胰蛋白酶购自鼎国生物技术公司，细胞增殖-毒性检测试剂盒Cell Counting Kit-8(CCK-8)购于Biosharp公司，二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司，Annexin-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒，PI细胞周期检测试剂盒购自凯基生物公司，Hoechst33258染色试剂购自biosharp公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 人成骨肉瘤MG-63细胞培养于含10%胎牛血清，100 U/mL的青霉素和100 U/mL的链霉素的DMEM培养基中，培养条件为恒温37℃，饱和湿度，CO2含量为5%。

1.2.2细胞活力测定 将收集的处于对数期的的细胞悬浮液接种于96孔板中，按照每孔100μL细胞悬浮液(含细胞5000个)进行接种，96孔板边缘的孔用无菌PBS填充。待培养24h，细胞贴壁后，吸去培养基，加入200μL含有不同浓度薏苡仁酯的培养基进行处理，空白对照组不接种细胞，但给予相应的完全培养基，实验对照组的细胞完全培养基处理，每个浓度设置6个复孔。培养特定的时间后，每孔加入20μL的CCK-8溶液，置于37℃培养箱中孵育1h。孵育结束后，用酶标仪测定450nm处的吸光值。细胞活力按照下面的公式进行计算：

细胞活力(%)=[(实验组平均吸光值-空白对照组平均吸光值)/(实验对照组吸光值-空白对照组平均吸光值)]×100。

1.2.3Annexin-FITC/PI双染法检测细胞凋亡 按每孔约2.5×105个细胞，将细胞接种到6孔板中，贴壁培养24 h后，给予不同浓度的薏苡仁酯处理24h，收集经过处理之后的细胞(包括悬浮细胞和贴壁细胞)，PBS洗涤两次后，取2×105个细胞重悬，1000g离心5min，弃上清，收集细胞，加入500μL的Binding buffer轻轻重悬细胞。加入5μL的Annexin-FITC，轻轻混匀；再加入5μL的PI，小心振荡摇匀。置室温避光条件下孵育10min后，上流式细胞仪进行检测。

1.2.4细胞形态学观察 采用细胞爬片法，将细胞接种到置于6孔板内的无菌盖玻片上，每孔约2.5×105个细胞，贴壁培养24h后，给予不同浓度的薏苡仁酯处理24h。药物处理完成后，吸去培养液，用PBS洗涤细胞两遍，多聚甲醛固定15min，然后加100μL浓度为10μg/mL的Hoechst 33258染料进行染色，染色时间为5min，染色结束后，小心取出盖玻片，用无菌PBS洗涤细胞两次，以洗去未结合的染料。洗涤完成后，将细胞置于激光共聚焦显微镜下观察并拍照，激发波长为350nm。

2结果

2.1薏苡仁酯抑制MG-63细胞增殖

CCK-8法显示，薏苡仁酯作用于MG-63细胞12h、24h、36h和48h后，不同药物浓度组存活率呈现剂量-时间依赖效应，薏苡仁酯作用于MG-63细胞12h、24h、36h、48h的IC50值分别为185.60g/L、113.65g/L、116.42g/L、47.60g/L。详见表1

表1 薏苡仁酯对MG-63细胞增殖抑制作用

2.2薏苡仁酯诱导MG-63细胞凋亡过程中核染色质的形态学变化

Hoechst染色如图1所示，薏苡仁酯作用于MG-63细胞12h、24h后，对照组荧光弥散均匀，处理组细胞核染色质形态学发生了改变，细胞核内染色质高度盘绕，出现许多被称为空穴现象的空泡结构，凋亡程度加深是染色质高度凝聚、边缘化，凋亡晚期细胞核破裂为碎块，产生凋亡小体。随着处理浓度加大，凋亡程度也随之加深。

图1 薏苡仁酯诱导MG-63细胞凋亡

2.3薏苡仁酯诱导MG-63细胞凋亡

Annexin-FITC/PI双染法如图2所示，薏苡仁酯作用于MG-63细胞24h后，凋亡为9.37%、10.61%、11.73%、14.26%，以晚期凋亡为主。

图2 薏苡仁酯对MG-63凋亡的影响

3讨论

骨肉瘤是起源于间叶组织的恶性肿瘤，多发于儿童及青少年，骨肉瘤的发病部位常见于长管状骨的干骺端[19]。在临床上，骨肉瘤仅表现为局部疼痛和肿胀，偶伴有关节功能障碍，早期极有可能发生肺转移，且发展迅速[20]。手术联合化疗模式，开启了骨肉瘤治疗的新时代。但近几十年来，骨肉瘤患者整体的5年生存率约为60%[19]。越来越多的实验表明，特异性诱导肿瘤细胞凋亡是一个新的行之有效的方法。

薏苡仁酯从中药薏苡仁中提取，是可供静脉或者动脉直接大剂量输注的新颖水包油型白色乳状液体，已证实可抑制和杀伤多种癌细胞，对中晚期肿瘤患者具有一定抗恶病质和止痛作用，无明显毒副作用[21]。因此，研究薏苡仁酯对骨肉瘤MG-63细胞增殖和凋亡的影响，以期将薏苡仁酯应用于骨肉瘤的临床治疗中提供实验基础。

研究发现，随着同一浓度薏苡仁酯处理MG-63细胞时间的延长，薏苡仁酯对MG-63细胞增殖的抑制作用逐渐增强。相同处理时间下，随着处理浓度的加大，薏苡仁酯对MG-63细胞增殖的抑制作用也随之增大。进一步研究薏苡仁酯对MG-63细胞凋亡的影响发现，Hoechst染色显示薏苡仁酯作用于MG-63细胞12h、24h后，对照组细胞呈现出均匀弥散荧光，而处理组出现细胞凋亡，细胞核和细胞质内出现浓染致密的块状荧光。Annexin-FITC/PI双染法检测结果表明，薏苡仁酯能够明显增加凋亡细胞比例，说明薏苡仁酯能够诱导MG-63细胞的凋亡。