干扰长链非编码RNA NEAT1上调miR-126抑制胃癌细胞的生长、间质转换及裸鼠肿瘤形成*

陶正贵 杜静虎 田 葵 王东华 胡凤琪 陈 钰

(1. 湖北文理学院附属医院，襄阳市中心医院普外科，襄阳 441000)(2. 襄阳市中心医院肾内科，襄阳 441000)

核富集的转录物1(nuclear paraspeckle assembly transcript 1，NEAT1)是近年来研究新发现的一个长链非编码RNA，作为细胞核内paraspeckles的重要组成，主要用于维持细胞核内mRNA的稳定、调节基因的表达[1]。临床研究发现，NEAT1在肿瘤的发生发展过程中，都存在异常高表达现象，并且与肿瘤的转移、分期、预后等密切相关[2-3]。miRNA是广泛存在真核生物中具有保守性的一类特异性的核苷酸[4]，可参与细胞的多种生物学行为，如细胞的增殖、分化、凋亡等[5-7]。miR126是一种高表达于内皮细胞、浆细胞样树突状细胞中的短链核苷酸[8]，研究显示其在肿瘤细胞中表达水平显著降低；恢复肿瘤细胞miR126的表达水平后，肿瘤增殖明显受到抑制[9]。目前，关于长链非编码RNA NEAT1与miR-126的靶向关系及对肿瘤的生物学行为研究尚无报道。因此，本研究主要探讨长链非编码RNA NEAT1与miR-126的靶向关系及对胃癌细胞的生物学行为影响，并通过构建移植瘤裸鼠模型，分析NEAT1对肿瘤生长的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

胃癌细胞MGC-803、SGC-7901和人胃上皮细胞购自ATCC；SPF级BALB/c雌性裸鼠20只，4～6周龄，体质量17～20 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(京)2017-0022。DMEM培养液及胰蛋白酶(上海生工生物工程有限公司)；胎牛血清(Gibco)；LipofecamineTM2000 TRIzol反转录试剂盒(Thermo Fisher)；SYBR PCR Master Mix试剂盒(TOYOBO)；Ki67、Caspase-3、N-cadherin、E-cadherin、β-actin、蛋白抑制剂等(Santa Cruz)；HRP羊抗兔IgG、HRP羊抗鼠IgG(Thermo)；Ki67、Caspase-3成套免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；NEAT1阴性对照病毒、NEAT1干扰shRNA(上海吉玛制药技术有限公司)；细胞裂解液、ECL化学发光试剂、MTT试剂及其他试剂、耗材(北京索莱宝科技有限公司)。

CO2培养箱(SanYo)；DNM-9606酶标分析仪(北京朗普新技术有限公司)；湿转仪(AB)；凝胶成像系统(DNR)；PCR仪(Thermo)；XD-202倒置显微镜(南京江南永新光学有限公司)；FACSCalibur流式细胞仪(BD)；电泳仪、图像采集及图像分析系统(Bio-Rad)；其他仪器购自Eppendorf。

引物序列：①NEAT1引物。F:5′-GGCAGGTCTAG TTTGGGCAT-3′，R:5′-CCTCATCCC TCCCAGTACCA-3′；②β-actin引物。F:5′-CCTCG CCTTT GCCGA TCC-3′，R:5′-GGATC TTCAT GAGGT AGTCA GTC -3′；③miR-126引物。F:5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3′；R:5′-GCCGCTCGTA CCGTGAGTAATAATG-3′。

1.2 方法

1.2.1细胞培养:用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的DMEN高糖培养基培养胃癌细胞MGC-803、SGC-7901和人胃上皮细胞GES-1，培养条件为37 ℃、5% CO2恒温恒湿。隔天换液1次，细胞融合度达到75%以上，3次传代后进行检测。

1.2.2慢病毒转染：取对数生长期的MGC-803和SGC-7901，调整细胞浓度为1×105个/mL，2 mL/孔，接种6孔板，继续培养，待细胞生长覆盖度达到50%按照试剂操作说明书要求进行慢病毒转染。阴性对照组(shRNA-NC)加入20 μL NEAT1阴性对照病毒(NEAT1-NC，滴度2×108TU/mL)，实验组(sh-NEAT1)加入6 μL NEAT1干扰病毒(NEAT1-shRNA，滴度9×108TU/mL)及2 μL polybrene(5 μg/μL)，对照组(control)加入20 μL培养基，转染过夜后(约16 h)，每天更换新鲜培养基。培养5 d后，加入终浓度为 2 μg/mL嘌呤霉素筛选耐药细胞株，Western blot鉴定病毒转染效果，将转染成功的细胞用于后续实验。

1.2.3细胞增殖：根据EDU染色试剂盒说明书，检测细胞增殖。完全培养基稀释EDU溶液，作用浓度为10 μmol/L， 100 μL/孔，孵育2 h后弃培养基，PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定，Apollo染色，立即检测或用抗荧光淬灭封片后，保存检测。

1.2.4流式细胞术检测细胞凋亡：取对数生长期细胞，调整细胞浓度为2.5×105个/mL，2 mL接种于6孔板，过夜培养(约16 h)。次日更换无血清培养基，诱导培养处理24 h。离心收集细胞于上样管，按照Annexin V-FITC试剂盒说明书向每管中依次加入150 μL AnnexinV-FITC结合液，3 μL AnnexinV-FITC和2 μL PI染液重悬细胞，室温暗室孵育15 min。加PBS至500 μL混匀过300目筛，30 min内上机检测，Cell Quest软件检测分析细胞凋亡情况。

1.2.5细胞侵袭实验：Transwell小室中将5 μg 纤黏连蛋白用移液器均匀涂抹在小室内的PVPF聚碳酸滤膜外表面；膜内侧表面涂5 μg基底胶。调整细胞量每室接种2×105个细胞，设置3个重复孔；培养4 h后PBS清洗3次并去除小室中膜内侧表面多余的细胞，4%多聚甲醛进行固定；随机选取10个视野, 倒置显微镜下采用双盲计数法统计膜下表面的细胞数目平均值。实验重复检测3次。

1.2.6划痕迁移实验：将划痕实验插件置于24孔板，取对数生长期的目的细胞，调整细胞量为5×105个，过夜培养(约16 h)。小心移去划痕实验插件，用完全培养基润洗3次，加入10 μmol/L丝裂霉素，继续培养2 h，更换新鲜完全培养基，显微镜下拍照，时间点为0 h，继续培养24 h拍照分析细胞的迁移情况。

1.2.7RT-PCR：依据TRIzol试剂盒提取各组细胞总RNA，测定RNA浓度及纯度，按照cDNA反转录试剂盒说明书，配置反转录PCR体系，设置PCR扩增程序进行反转录扩增，用SYBR PCR Master Mix试剂盒对miR-126表达水平进行检测，内参基因选择β-actin管家基因，引物的合成由Thermo Fisher完成。

1.2.8荧光素酶报告实验：用RT-PCR扩增miR-126片段，纯化后以pMIR-REPORT为基因载体，构建miR-126野生质粒，采用基因突变技术构建miR-126突变质粒，LipofecamineTM2000分别或同时对TPC-1细胞进行转染，各组荧光素酶活性依据Dual Luciferase报告基因试剂盒进行分析。

1.2.9蛋白表达检测：将目标细胞或组织裂解液冰浴裂解30 min取上清液提取总蛋白，酶标仪490 nm波长蛋白定量。12% SDS-PAGE电泳分离，采用湿转法将蛋白转至硝酸纤维素膜上，4 ℃条件依次加入封闭液孵育2 h，一抗孵育过夜(稀释比例均为1∶1 000)，二抗孵育2 h(稀释比例均为1∶5 000)。用ECL化学发光试剂显色，在凝胶成像系统检测分析蛋白条带，蛋白表达定量分析用Image J图像分析软件对条带进行分析，内参采用β-actin。

1.2.10移植瘤裸鼠模型构建及处理：20只SPF级BALB/c 裸鼠随机分为2组，10只/组，对照组每只裸鼠左侧腋窝外侧皮下注射0.2 mL SGC-7901细胞培养液，模型组注射0.2 mL转染sh-RNA的SGC-7901细胞培养液，细胞接种量均为5×106个/只，SPF级饲养环境中分笼饲养，注射1周后记录每只裸鼠的成瘤情况，剔除移植瘤失败或30 d内死亡裸鼠，使用游标卡尺测量肿瘤的最大直径和最小直径，肿瘤体积=(最大直径×最小直径)2/2。30 d后，将裸鼠处死，体内完整的取下瘤组织精确称量瘤的质量。

1.2.11免疫组化分析：取各组裸鼠肿瘤组织样本，经4%多聚甲醛固定后，做成组织切片，按照试剂盒说明书操作进行Ki67和Caspase-3免疫组化染色，显微镜下观察组织中蛋白表达。

1.3 统计方法

2 结果

2.1 NEAT1在胃癌细胞中表达分析

通过胃癌细胞和正常的胃上皮细胞NEAT1 mRNA表达分析结果显示，NEAT1在胃癌细胞SGC-7901和MGC-803中的表达水平显著高于正常胃上皮细胞GES-1，差异有统计学意义(P<0.05)。慢病毒转染sh-NEAT1敲除肿瘤细胞中NEAT1，Western blot分析显示，与对照组相比，sh-NEAT1组SGC-7901和MGC-803细胞中NEAT1表达水平显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)，而shRNA-NC组细胞中NEAT1表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，见图1。

图1 NEAT1在胃癌细胞中表达分析注：与对照组相比，*P<0.05Fig.1 Analysis of NEAT1 expressionin gastric cancer cellsNote：Compared with control group，*P<0.05

2.2 NEAT1沉默对胃癌细胞增殖的影响

通过BrdU分析NEAT1沉默对胃癌细胞增殖的影响结果显示，与对照组相比，sh-NEAT1组SGC-7901和MGC-803细胞增殖水平显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)，而shRNA-NC组细胞的增殖水平差异无统计学意义(P>0.05)，见图2A。通过Western blot对各组细胞Ki67蛋白表达分析显示，与对照组相比，sh-NEAT1组SGC-7901和MGC-803细胞中Ki67表达水平显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)，而shRNA-NC组细胞中Ki67表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，见图2B。流式细胞术分析NEAT1沉默后细胞凋亡情况结果显示，与对照组相比，sh-NEAT1组SGC-7901和MGC-803细胞的凋亡比例显著上升，差异有统计学意义(P<0.05)，而shRNA-NC组细胞凋亡情况差异无统计学意义(P>0.05)，见图2C。Western blot结果显示，与对照组相比，sh-NEAT1组SGC-7901和MGC-803细胞中Caspase-3表达水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)，而shRNA-NC组细胞中Caspase-3表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，见图2D。

图2 NEAT1沉默对胃癌细胞增殖的影响注：与对照组相比较，*P<0.05Fig.2 Effect of NEAT1 silencing on proliferation of gastric cancer cellsNote：Compared with control group，*P<0.05

2.3 NEAT1沉默对胃癌细胞侵袭及迁移能力的影响

通过Transwell小室和划痕实验分析NEAT1沉默对胃癌细胞侵袭、迁移能力的影响结果显示，与对照组相比，sh-NEAT1组SGC-7901和MGC-803的浸润细胞比例显著减少，划痕细胞覆盖率明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，而shRNA-NC组细胞的浸润比例和划痕覆盖率差异无统计学意义(P>0.05)，见图3A、图3B。Western blot分析显示，与对照组相比，sh-NEAT1组SGC-7901和MGC-803细胞中E-cadherin表达水平显著升高，N-cadherin表达水平明显下降，差异均有统计学意义(P<0.05)，而shRNA-NC组细胞中E-cadherin和N-cadherin表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，见图3C。

图3 NEAT1沉默对胃癌细胞侵袭及迁移能力的影响注：与对照组相比，*P<0.05Fig.3 Effect of NEAT1 silencing on invasion and migration of gastric cancer cellsNote: Compared with control group，*P<0.05

2.4 NEAT1靶向miR-126关系分析

靶向基因在线软件分析发现，miR-126序列中存在NEAT1的结合位点(图4A)。分析各组细胞miR-126的表达水平结果显示，miR-126在胃癌细胞SGC-7901和MGC-803中的表达水平明显低于正常胃上皮细胞GES-1，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4B。NEAT1基因沉默后，胃癌细胞SGC-7901和MGC-803的miR-126表达水平显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4C，表明NEAT1能够抑制miR-126表达。靶向调控关系的荧光素酶结果(图4D)显示，miR-126作用后NEAT1野生质粒的荧光素酶活性显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，而NEAT1突变质粒的荧光素酶活性无明显影响，这表明NEAT1和miR-126之间存在靶向调控关系。

图4 NEAT1靶向miR-126关系分析Fig.4 Analysis of relationship of NEAT1 targeting miR-126

2.5 NEAT1/miR-126对生长和运动的调节

BrdU增殖结果显示，沉默NEAT1后，SGC-7901细胞的增殖明显受到抑制(P<0.05)，miR-126抑制剂能促进SGC-7901细胞的增殖，并显著减弱sh-NEAT1对SGC-7901细胞的增殖抑制作用(P<0.05，图5A)。流式细胞术结果显示，沉默NEAT1后，SGC-7901细胞的凋亡比例显著增加(P<0.05)，miR-126抑制剂能促进SGC-7901的细胞凋亡，并显著抑制sh-NEAT1对SGC-7901细胞的凋亡诱导作用(P<0.05，图5B)。Transwell小室和划痕实验结果显示，沉默NEAT1后，SGC-7901细胞的侵袭、迁移能力明显受到抑制(P<0.05)，miR-126抑制剂能促进SGC-7901细胞的侵袭、迁移，并显著减弱sh-NEAT1对SGC-7901细胞侵袭、迁移能力的抑制作用(P<0.05)，见图5C、图5D。

图5 NEAT1/miR-126对生长和运动的调节注：与对照组相比,*P<0.05；与sh-NEAT1组相比，#P<0.05Fig.5 Regulation of growth and movement by NEAT1/miR-126Note：Compared with control group，*P<0.05；Compared with sh-NEAT1 group，#P<0.05

2.6 NEAT1对裸鼠体内肿瘤的影响

裸鼠体内抗肿瘤结果显示，NEAT1基因沉默后，与对照组相比，sh-NEAT1组裸鼠肿瘤的体积增大速度明显低于对照组(P<0.05，图6A)，但sh-NEAT1组裸鼠肿瘤质量显著高于对照组(P<0.05，图6B)。分析肿瘤组织中蛋白表达水平结果显示，NEAT1基因沉默后，与对照组相比，sh-NEAT1组裸鼠肿瘤细胞中NEAT1的表达水平显著降低，miR-126的表达水平显著升高(P<0.05，图6C)。免疫组化结果显示，NEAT1基因沉默后，与对照组相比，sh-NEAT1组裸鼠肿瘤组织中Ki67的表达量显著降低，Caspase-3的表达量显著增加(P<0.05，图6D)；Western blot结果显示，NEAT1基因沉默后，与对照组相比，sh-NEAT1组裸鼠肿瘤组织中N-cadherin的表达量显著降低，E-cadherin的表达量显著增加(P<0.05，图6E、图6F)。

图6 NEAT1对体内肿瘤的影响注：与对照组相比,*P<0.05Fig.6 Effects of NEAT1 on tumors in vivoNote: Compared with control group,*P<0.05

3 讨论

长链非编码RNA多是由RNA聚合酶Ⅱ转录而来，其长度约200 bp。研究显示，多数的长链非编码RNA为原癌基因，虽然不具有蛋白质翻译功能，却通过参与其他基因的表达调控，影响细胞的增殖、侵袭和转移[10-12]。NEAT1是由人11号染色体上的多发性内分泌瘤病基因位点的RNA聚合酶Ⅱ转录而成，它能够与多个靶基因相结合，调控靶基因的表观遗传谱，从而促进癌基因的表达，促进肿瘤的生长和转移[13]。miR-126在机体内主要发挥抑肿瘤作用。

本研究结果显示，NEAT1在胃癌细胞SGC-7901和MGC-803中的相对表达水平显著高于正常胃上皮细胞GES-1，与Choudhry等[14]在乳腺癌中的研究结果一致。通过病毒转染sh-NEAT1对干扰肿瘤细胞NEAT1表达后发现，SGC-7901和MGC-803细胞中NEAT1相对表达水平显著下降，而转染shRNA-NC组细胞中NEAT1相对表达水平无明显变化，表明慢病毒转染能够获得稳定sh-NEAT1胃癌细胞系。通过BrdU染色[15]检测细胞增殖发现，转染sh-NEAT1后SGC-7901和MGC-803细胞BrdU阳性细胞率明显减低，表明细胞增殖受到了抑制。对细胞中Ki67蛋白表达水平检测发现，Ki67蛋白相对表达水平明显降低，由于Ki67是一种存在于增殖细胞中的核抗原，与染色质的合成、细胞有丝分裂密切相关[16]，其表达水平降低，表明能够抑制肿瘤细胞的增殖。流式细胞术结果显示，转染sh-NEAT1后，SGC-7901和MGC-803细胞的凋亡率明显升高，细胞中Caspase-3表达水平也明显升高。Caspase-3是参与和执行细胞凋亡的重要蛋白，当凋亡信号传递并激活下游Caspase-3的表达时，表明细胞已进入凋亡不可逆时期[17]。NEAT1表达沉默后，胃癌细胞的增殖能力明显降低，凋亡水平明显升高，可见NEAT1能够通过促进细胞增殖抑制细胞凋亡发挥原癌基因的作用。

上皮间质转化(EMT)是指上皮细胞暂时丧失细胞极性并有间质细胞特征，获得移动能力。本研究通过Transwell小室和划痕实验分析NEAT1沉默对胃癌细胞侵袭、迁移能力的影响，结果显示，沉默NEAT1后，胃癌SGC-7901和MGC-803的侵袭能力和迁移能力明显受到抑制。Western blot分析显示，肿瘤细胞中E-cadherin表达水平显著提升，N-cadherin表达水平明显下降，由于细胞发生EMT过程中，肿瘤细胞通过改变自身细胞形态，丧失细胞极性，与其他细胞分离，形成伪足，增强自身的迁移能力[18-19]。同时通过下调细胞黏附因子E-Cadherin的表达[20]，上调质型细胞标记物如波形蛋白(Vimentin)[21]、N-Cadherin表达，将角蛋白细胞骨架变为波形细胞骨架，促进细胞穿透胞间连接，增强细胞的侵袭能力[22]。沉默NEAT1的表达后，SGC-7901和MGC-803细胞的N-cadherin的表达显著降低，表明其EMT机制显著受到抑制，从而降低肿瘤细胞的侵袭能力。

本研究结果显示，miR-126在胃癌细胞中的相对表达水平明显低于正常胃上皮细胞GES-1，与Rouigari等[23]关于miR-126能够发挥抑癌作用的研究一致。NEAT1沉默后，胃癌细胞SGC-7901和MGC-803的miR-126表达水平显著增高(P<0.05)，表明NEAT1能够抑制miR-126表达，本研究发现miR-126是NEAT1的潜在靶向位点，miR-126作用后，NEAT1野生质粒的荧光素酶活性显著降低，而NEAT1突变质粒的荧光素酶活性无明显影响，这进一步证实了NEAT1靶向调控miR-126。由于NEAT1基因沉默后，胃癌细胞SGC-7901的miR-126表达水平相对高于MGC-803细胞，因此本研究选择SGC-7901细胞研究NEAT1/miR-126对生长和运动的调节，结果显示NEAT1沉默后使用miR-126 inhibitor能够恢复沉默NEAT1引起的SGC-7901细胞的增殖、侵袭、迁移抑制，细胞凋亡增强的细胞表型，提示在胃癌细胞中NEAT1能够上调miR-126表达抑制细胞增殖，通过阻断EMT机制降低肿瘤细胞的侵袭及转移能力。

体内移植瘤实验表明，NEAT1基因沉默后，裸鼠肿瘤的体积增长受到抑制，但sh-NEAT1组裸鼠肿瘤质量显著高于对照组，这可能是由于sh-NEAT1抑制肿瘤细胞的EMT机制，抑制细胞侵袭能力，促使细胞在局部增殖，从而使得肿瘤体积未变，而质量显著增加。免疫组化结果显示，NEAT1基因沉默后，裸鼠肿瘤组织中Ki67和N-cadherin的表达量显著降低，而Caspase-3及E-cadherin的表达量显著增加，表明sh-NEAT1在体内依旧能够发挥抑制肿瘤细胞侵袭转移的作用。

综上所述，干扰长链非编码RNA，NEAT1能够上调胃癌细胞中miR-126的表达水平，通过诱导细胞凋亡以抑制胃癌细胞的增殖，同时抑制细胞的EMT机制，达到抑制肿瘤的侵袭、转移及裸鼠肿瘤形成的目的。