脑胶质瘤患者异柠檬酸脱氢酶（IDH）1/2基因突变与O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）基因启动子区甲基化的相关性研究

林华亮 郑泽洲 郑伟杰

1.广东省汕头市龙湖区第二人民医院急诊外科，广东汕头 515041；2.广东省汕头市中心医院神经外二科，广东汕头515100；3.广东省汕头潮南民生医院神经外科，广东汕头 515144

脑胶质瘤属于中枢神经系统比较常见的恶性肿瘤，但是WHO规定，Ⅰ级脑胶质瘤通过手术完全切除治愈，绝大部分Ⅱ～Ⅳ级脑胶质瘤会经常性复发，增加了患者的生活压力[1-2]。随着医学的不断发展，很多疾病的治愈效率明显提高，但是对于脑胶质瘤的研究表明[3-4]，其生存时间没有得到根本性改善。随着脑胶质瘤WHO经典组织学分级方案的制订，越来越多的研究表明分子遗传学的分类方案和患者预后有着密切的关系[5-6]。目前最新的胶质瘤分类，将经典组织学分级和分子遗传学的分类进行结合，从而对胶质瘤进行综合性的研判。有研究表明[7-8]，2008年，异柠檬酸脱氢酶（IDH）1/2基因在胶质瘤患者全基因组测序中被发现，其和脑胶质瘤有着密切的关系，同时IDH 1/2突变和患者的生存时间也有一定的关联性。本研究通过分析汕头市龙湖区第二人民医院普外科2018年1月至2020年2月脑胶质瘤患者60例临床资料进行分析，拟探讨脑胶质瘤患者IDH1/2基因突变与O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）基因启动子区甲基化的相关性，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取汕头市龙湖区第二人民医院普外科2018年1月至2020年2月脑胶质瘤患者60例临床资料进行分析，其中男40例，女20例，年龄4～77岁，平均（40.3±15.2）岁。按照中枢神经系统组织学分类，Ⅰ级3例，毛细胞型星形胶质细胞瘤3例，Ⅱ级12例，少突星形细胞瘤3例、弥漫星形细胞瘤4例、星形细胞瘤1例、少突胶质细胞瘤4例，Ⅲ级15例，间变星形细胞瘤9例、间变少突胶质细胞瘤6例，Ⅳ级30例，胶质肉瘤5例、多形性胶质母细胞瘤25例。纳入标准：①患者生存质量评分＞60分；②通过手术和组织病理学证实结果为恶性脑胶质瘤；③患者血红蛋白≥100 g/L。排除标准：①心脏、肝、肺和肾脏重要脏器功能异常患者；②身体和其他脏器肿瘤患者；③接受放化疗或免疫性治疗患者；④严重性过敏患者。

1.2 方法

1.2.1 IDH 1/2基因突变的检测方法 对IDH 1/2基因突变进行测序。首先通过患者肿瘤标本组织进行DNA提取，采用紫外分光光度计（SHIMADZU/岛津）观察DNA是否符合要求，对合格的DNA进行扩增，琼脂糖凝胶电泳法观察扩增基因。去除扩增产物中的杂质，如脱氧核糖核苷三磷酸、引物二聚体、蛋白质和无机盐等，然后在将PCR产物作为模板，以脱氧核糖核苷三磷酸和双脱氧核苷三磷酸作为底物进行荧光标记，完成线性扩增，形成了仅差1个碱基对的部分片段混合物，通过去除杂志，纯化PCR产物，高温让双链DNA变性，采用毛细管电泳，观察结果，进行待测模板序列的判读。

1.2.2 MGMT基因启动子区甲基化的检测 通过甲基化特异性PCR（MSP）法进行检测，首先将肿瘤标本组织进行DNA提取，采用紫外分光光度计观察DNA是否符合要求，通过亚硫酸盐对DNA进行甲基化修饰，PCR扩增特异性引物，凝胶电泳检测MSP的产物，凝胶成像系统观察结果。

1.3 观察指标及评价标准

①观察脑胶质瘤患者IDH 1/2基因突变与MGMT基因启动子区甲基化情况。甲基化判定标准[9-10]：甲基化的特异性引物出现扩增条带，但是非甲基化引物没有扩增条带，两种特异性引物均有扩增条带出现。②观察IDH 1/2基因突变与MGMT基因启动子区甲基化相关性分析情况。

1.4 统计学分析

采用统计学软件SPSS 23.0建立数据库，针对计数资料通过百分率（%）表示，采用χ2检验分析，相关性分析通过Spearman相关性分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑胶质瘤患者IDH 1/2基因突变与MGMT基因启动子区甲基化情况

18例检测出IDH 1/2基因突变，其中WHO的分级Ⅱ级8例、Ⅲ级7例，Ⅳ级3例，分级在IDH 1/2基因突变分布中，差异有统计学意义（χ2=108.454，P=0.000），33例检测出MGMT基因启动子区甲基化，其中WHO的分级Ⅰ级2例、Ⅱ级8例、Ⅲ级8例，Ⅳ级15例，分级在MGMT基因启动子区甲基化分布中，差异无统计学意义（χ2=0.527，P=0.538）。见表1。

2.2 IDH 1/2基因突变与MGMT基因启动子区甲基化相关性分析情况

IDH 1/2基因突变与MGMT基因启动子区甲基化呈明显正相关，差异有统计学意义（r=0.368，P=0.014）。

3 讨论

IDH 1/2基因处于人体染色体2q33，3上的IDH 1/2基因基因编码，属于三羧酸循环限速酶的一种，参与细胞能量代谢[11-12]。有资料显示[13-14]，组织学分级相同的脑胶质瘤患者，IDH 1/2基因突变型高于野生型的预后，说明IDH 1/2基因突变和脑胶质瘤预后预测有一定的关系。本研究中，18例检测出IDH 1/2基因突变，其中WHO的分级Ⅱ级8例、Ⅲ级7例，Ⅳ级3例，分级在IDH 1/2基因突变分布中，差异有统计学意义，需要将形态组织学和基因分型密切的结合，才可以更加准确判定脑胶质瘤的预后水平[15-16]。MGMT属于DNA修复蛋白的一种，对其编码的基因处于染色体10q26。有资料显示，放疗联合化疗的患者，MGMT基因启动子区甲基化的生存率较高，同时MGMT甲基化在烷化剂化疗中更加敏感，在脑胶质瘤患者预后判定中具有重要的意义[17-18]。本研究中，33例检测出MGMT基因启动子区甲基化，其中WHO的分级Ⅰ级2例、Ⅱ级8例、Ⅲ级8例，Ⅳ级15例，分级在MGMT基因启动子区甲基化分布中，差异无统计学意义，此结果和国外研究结果基本一致[19-20]。IDH 1/2基因突变与MGMT基因启动子区甲基化呈现明显正相关，提示可能因IDH 1/2基因突变型的脑胶质瘤中，2-羟基戊二酸蓄积有密切的关系，同时，2-羟基戊二酸积累对于调节DNA甲基化酶形成竞争性抑制，造成患者CpG岛甲基化表型进展，进而诱导MGMT基因启动子区甲基化。此结果也印证了有关学者研究中，MGMT基因启动子区域甲基化和转录沉默，增加了遗传的不稳定性，也就是促进出现了G和A转录因子，进而造成IDH1/2 的132位上的基因突变。此结果和Turcan等[21]研究中，靶向的DNA甲基化可以将IDH1/2基因突变的甲基化逆转，进而对脑胶质瘤起始细胞的分化形成阻断，有利于控制肿瘤进展，为指导脑胶质瘤治疗提供依据。

表1 脑胶质瘤患者IDH 1/2基因突变与MGMT基因启动子区甲基化情况

综上所述，脑胶质瘤患者IDH1/2基因突变与MGMT基因启动子区甲基化呈正相关，为指导临床诊断治疗，提供了理论依据。