不同核酸提取方法SARS-CoV-2核酸检测性能比较

张云丽， 王 鑫， 邵 玲， 曲 波， 赵鸿梅

（辽宁省人民医院检验医学科，辽宁 沈阳 110016）

2020年2月11日，国际病毒分类委员会将新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）的致病原命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）[1]。我国国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）》[2]中规定实时荧光逆转录聚合酶链反应（real-time fluorescence reverse transcription-polymerase chain reaction，RTPCR）检测SARS-CoV-2阳性为COVID-19的确诊指标之一。实时荧光RT-PCR具有灵敏度高、特异性强的特点[3]，在COVID-19早期诊断及阻断疾病传播中起关键作用，为SARS-CoV-2感染的防控提供了强有力的保障[4]。

目前，SARS-CoV-2核酸检测普遍在各医疗机构的二级及以上生物安全实验室开展。大部分实验室在进行SARS-CoV-2核酸检测时都会按照试剂说明书要求使用配套核酸提取或纯化试剂（磁珠吸附法），将采集的鼻/咽拭子置于病毒保存液中，56 ℃灭活30 min后使用自动化设备提取核酸。样本释放剂法是将采集的拭子样本放入含有样本核酸释放剂的保存液中，使样本中的RNA释放，依据液可直接作为聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）模板进行扩增，无需加热灭活或其他核酸提取操作。该法操作更为简便，耗时更短。本研究参照CNAS-CL02-A009《医学实验室质量和能力认可准则在分子诊断领域的应用说明》[5]、CNAS-GL039《分子诊断检验程序性能验证指南》[6]文件对这2种不同的核酸提取方法所使用的3种试剂进行符合率、重复性、检出限比较，评估样本释放剂是否可替代磁珠吸附法应用于临床，为实验室人员合理选择SARSCov-2 核酸提取方法提供参考。

1 材料和方法

1.1 研究对象

阳性样本为SARS-CoV-2 RNA液体性能验证标准品（广州邦德盛公司）。浓度为2.0×106拷贝/mL及2.0×105拷贝/mL的SARS-CoV-2 RNA假病毒核酸标准品编号分别为GBW（E）091133及GBW（E）091132。阴性样本为健康体检者的咽拭子样本。

1.2 试剂和仪器

样本释放剂A购自广东国盛医学科技有限公司。样本释放剂B、磁珠吸附法核酸提取试剂和DA3200核酸提取仪、SARS-CoV-2核酸检测试剂均购自广州中山大学达安基因股份有限公司。Cobas z480实时荧光定量PCR仪购自瑞士罗氏公司。XK80-A型快速混匀器购自深圳市瑞鑫达科教仪器贸易部。

1.3 检测方法

1.3.1 核酸提取 按照样本释放剂法核酸提取试剂的说明书，采集样本后将采样管灭活、震荡、离心，吸取上清液作为PCR模板，加入到PCR体系中进行扩增。按照磁珠吸附法核酸提取试剂的说明书，使用核酸提取仪自动提取SARSCoV-2 RNA，样本用量为200 μL，核酸洗脱液体积为100 μL。

1.3.2 实时荧光RT-PCR 采用SARS-CoV-2核酸检测试剂盒对不同核酸提取方法制备的SARS-CoV-2 核酸进行检测。严格按试剂盒说明书进行操作，实时荧光RT-PCR条件：50 ℃ 15 min；95 ℃ 15 min；94 ℃ 15 s，55 ℃ 45 s，40个循环。FAM通道结果代表SARS-CoV-2 N基因，VIC通道结果代表SARSCoV-2 ORF1ab基因，Cy5通道结果代表内标基因。阳性标准为FAM和VIC通道有明显扩增曲线，且循环阈值（cycle threshold，Ct）≤40；阴性标准为FAM和VIC通道无扩增曲线或Ct值>40，且Cy5通道有扩增曲线；如仅在FAM或VIC单一通道Ct≤40，另一条通道无扩增曲线，结果需复检，复检结果一致可判为阳性，复检均为阴性则为阴性。

1.4 方法比较

1.4.1 符合率 选取阴性样本10例、阳性标准品10例。分别采用样本释放剂法和磁珠吸附法提取SARS-CoV-2 核酸后进行检测并以Ct值评价结果的阴、阳性。以磁珠吸附法为参比方法，样本释放剂法为待评价方法，根据2种方法的检测结果计算不同方法间的总符合率、阴性符合率及阳性符合率。

1.4.2 重复性 10份2水平（低值、中值）阳性质控品分别使用不同核酸提取方法进行核酸提取及扩增。根据实时荧光RT-PCR的Ct值变异系数（coefficient of variation，CV）比较不种方法的重复性。

1.4.3 检出率和检出限 将含有2.0×104拷贝/mL SARS-CoV-2 核酸的定值标准品用去RNA酶水进行20～28倍梯度稀释，稀释后的样本使用不同核酸提取试剂进行检测，每水平重复5次，根据Ct＜40阳性结果的检出率评价各方法的检出率及检出限。

1.5 统计学方法

采用Excel 2013软件、GraphPad Prism 5.0软件进行统计分析。

2 结果

2.1 符合率

阳性标准品使用3种试剂提取核酸后检出结果均为阳性（N基因、ORF1ab基因及内标基因Ct值均＜40）。经过严格临床培训的采样人员使用3种不同试剂采集的10例正常人咽拭子样本，结果均为阴性（N基因及ORF1ab基因未检出，内标基因Ct值＜40）。3种核酸提取试剂的总符合率、阳性符合率及阴性符合率均为100%。见图1。

图1 3种不同核酸提取试剂阴阳性样本的符合率结果

2.2 重复性

使用3种核酸提取试剂对低值质控品及中值质控品进行核酸提取及扩增。低值质控品均值为1.61×103拷贝/mL，浓度范围为5.04×102～5.17×103拷贝/mL；中值质控品均值为1.45×104拷贝/mL，浓度范围为4.60×103～4.55×104拷贝/mL）。磁珠吸附法试剂提取核酸的CV（CV为0.89%～1.58%）低于样本释放剂B（CV为0.83%～2.73%）和样本释放剂A（CV为1.62%～4.90%）。见表1。

表1 3种核酸提取试剂对低值和中值质控品进行核酸提取及扩增的重复性

2.3 检出率和检出限

磁珠吸附法提取核酸后N基因的检出率为100%，ORF1ab基因的检出率为97.8%，2个基因同时检出的检出率为97.8%。样本释放剂A提取核酸后N基因的检出率为84.4%，ORF1ab基因的检出率为75.6%，2个基因同时检出的检出率为75.6%。样本释放剂B提取核酸后N基因的检出率为100%，ORF1ab基因的检出率为93.3%，2个基因同时检出的检出率为93.3%。使用磁珠吸附法试剂进行核酸提取的检出限为156.3拷贝/mL，样本释放剂A的检出限为625.0拷贝/mL，样本释放剂B的检出限为156.3拷贝/mL。见图2。

图2 3种不同核酸提取试剂梯度稀释（20～28倍）样本检测结果

3 讨论

COVID-19疫情作为突发公共卫生事件，传播迅速、广泛，给全世界人民的生命健康带来巨大威胁[7]。敏感性及特异性较高的核酸检测方法为病毒的早期诊断、疫情监测提供了可行的解决方案[8]。目前，SARS-CoV-2核酸检测一般使用实时荧光RT-PCR。在检测过程中，病毒核酸的提取是关键步骤之一，提取的效率和质量可直接影响最终检测结果的准确性。不同的核酸提取方法因其提取产物浓度、纯度的差别及对核酸的保护程度不同，一定程度上影响病毒核酸尤其是临界阳性标本的核酸检出[9]。因此，选择一种高效的核酸提取方法，对保证核酸检测结果的快速与准确是至关重要的。

理论上，病毒载量越高，提取的病毒核酸越多，可以反映在所对应检测结果的Ct值上[10]。张运洪等[11]的研究结果显示，使用核酸裂解液进行SARS-CoV-2核酸提取检出率低，效果不如磁珠吸附法好。本研究从符合率、重复性及检出率综合比较样本释放剂法与磁珠吸附法的性能，分析其优缺点，以期找到更适用于临床的核酸提取方法。

本研究发现，在符合率方面，3种核酸提取试剂的阴、阳性样本结果符合率均为100%。在重复性方面，磁珠吸附法试剂提取核酸的CV最低，重复性最佳，样本释放剂B次之，样本释放剂A的 CV最大。检测不同浓度水平的样本，磁珠吸附法试剂提取核酸后N基因和ORF1ab基因同时检出的检出率为97.8%，样本释放剂A为75.6%，样本释放剂B为93.3%。磁珠吸附法及样本释放剂B的检出限均为156.3 拷贝/mL，样本释放剂A的检出限为625.0 拷贝/mL。3种试剂说明书声明的检出限均为500 拷贝/mL。磁珠吸附法试剂及样本释放剂B的检出限符合要求，而样本释放剂A的检出限不符合要求。在提取操作时间上，磁珠吸附法通过仪器自动化或半自动化分批进行核酸提取，提取前后都需要手工加样。使用样本释放剂无需设备，只需震荡、静置、离心后加样1次即可完成，操作更为简便。因此，磁珠吸附法适合大批量样本，样本释放剂法适合少量样本。磁珠吸附法的试剂成本高于样本释放剂法。

磁珠吸附法的原理是通过含强力蛋白变性剂的磁珠结合液将样本中的蛋白质迅速溶解，使核酸解离出来结合在磁珠上，随后通过磁场的作用和磁珠洗涤液的作用将杂质去除，最后将纯净的核酸洗脱下来。样本释放剂主要成分包括核酸释放液和保存液，可使细胞或病毒的蛋白质结构变性，灭活病毒，通过震荡和浸泡使核酸被快速释放，对核酸具有一定的保护作用。采样后按说明书要求震荡、静置、离心，即可吸取上清液作为模板，加入PCR体系进行扩增。磁珠吸附法是目前较常用的核酸提取方法，具有简便、高效、提取浓度及纯度较高等优势[12-13]，且可通过仪器自动化批量提取，操作简单。磁珠吸附法与样本释放剂法相比，经过了去除杂质的核酸提纯过程，且每份样本加样量相对均一，结果重复性好。样本释放剂法不经提纯，得到的核酸量与采样人员的采样操作密切相关，虽然操作快速、简便，但结果重复性不如磁珠吸附法好。另外，由于试剂组分不同，不同样本释放剂的核酸提取性能也有一定的差异。

综上所述，相对于样本释放剂法，磁珠吸附法提取效率更高、结果重复性更好，适合大批量样本的操作。