基于CRISPR-Cas13的单增李斯特菌RNA快速检测方法的建立

曾红棱，张婷，邓锐杰，任尧，贾利蓉

（四川大学轻工科学与工程学院，四川成都 610065）

单增李斯特菌（L.monocytogenes）是一种重要的食源性致病菌，其广泛存在于土壤、植物、水，人及动物粪便中，主要污染食品基质为肉类、熟食、乳制品及海鲜类食品[1]，感染可导致败血症，脑膜炎，肠胃炎和流产[2]，其在冷藏温度和高盐浓度（10% NaCl）下仍能保持生存和增长[3]，因此，单增李斯特菌污染对于食品安全及人类健康皆构成了巨大威胁。为了有效防止单增李斯特菌的危害，迫切需要发展一种高度特异性、快速、准确的食品中检测方法。

单增李斯特菌的检测方法依赖培养富集，然后是传统的生化培养法培养、免疫学法或以聚合酶链式反应（PCR）为基础的分子生物学方法[4]。传统培养法检测周期较长，约为4～6 d[5]，无法满足大量样品的检测。免疫学法[6]主要包括ELISA，免疫胶体金技术和免疫磁分离技术，可以实现不依赖培养的单增李斯特菌检测，有望实现现场检测，然而，抗体比较昂贵，较难保存，限制了这些方法的广泛应用。针对核酸的检测技术[7]传统PCR，多重PCR（mPCR）和实时定量PCR（qPCR）可鉴定和高灵敏检测不同微生物。Liu Z等[8]开发了基于DNAzyme的PCR信号级联扩增技术，可实现肉眼检测食品中的李斯特菌。但PCR引物的设计极为关键，否则容易非特异性扩增产生假阳性或假阴性结果，且对于温度和仪器要求较高。等温核酸扩增的出现可消除核酸扩增技术对控温设备的依赖。Feng J等[9]将核酸适配体与LAMP检测技术结合，建立了对单增李斯特菌的AMC-LAMP可视化检测体系，检出限为5 CFU/mL。此外，一些基于荧光、比色、表面等离子共振、电化学的传感器检测技术[10-13]也得到了发展。GUO Y[14]结合免疫磁捕获和聚集诱导发光（AIE）检测单核细胞增生李斯特，无需任何预富集，且具有良好的选择性，加标回收率在95.37%至101.90 %。

但以DNA为检测模板的核酸分析方法无法区分死菌和活菌，假阳性率较高，且通常认为活菌对于食品安全及人类健康风险更大[15]。由于RNA分子通常具有较短的半衰期，在死菌中迅速降解，因为认为RNA检测更适用于准确检测活致病菌[16]。CRISPRCas（成簇的规则间隔的短回文重复序列）是一类特殊的核酸蛋白复合体，可依赖靶标单链RNA，切割无关的ssRNA，适用于RNA检测[17]。Zhou J等[18]建立了一种基于CRISPR-Cas13a检测金黄色葡萄球菌的方法，通过靶标RNA激活Cas13a-crRNA复合物的切割能力，切割荧光探针，导致荧光值增加，该方法具有较高的灵敏性，特异性，可在4 h内完成检测。但目前基于CRISPR-Cas13a的检测方法仍然需要通过逆转录过程获得cDNA，再进一步核酸扩增，此外一般需要在RNA报告探针的两端修饰荧光基因和淬灭基团，检测成本昂贵，操作流程也较为繁琐，无法满足同时具有高效率、高灵敏度、强特异性和低成本的需求。

因此设计了一种CRISPR-Cas 13直接切割RNA序列以检测活性致病菌的方法，以Broccoli适配体作为信号探针，后者可特异结合荧光染料产生荧光信号[19]，无需化学合成和修饰。该方案无逆转录、无核酸扩增，可定量检测活的单增李斯特菌，检测耗时短，具有较高的选择性和灵敏度，有望实现食品中单增李斯特菌的实时现场检测。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

单增李斯特菌（L.monocytogenes）（ATCC 19115）、大肠杆菌（E.coli）（ATCC 25922）、鼠伤寒沙门氏菌（S.enterica）（ATCC 14028）和蜡样芽孢杆菌（B.cereus）（ATCC 14579）由中国工业培养收藏中心（CICC）提供；所有DNA寡核苷酸序列（表1）均购于上海生工生物技术有限公司（并通过PAGE进行纯化）；Cas 13（cat.no.32117）购于Tolobio，中国上海；phi 29 DNA聚合酶和T7 RNA聚合酶购自Thermo Fisher Scientific（Waltham，USA）；DNase I，dNTPs和rNTPs购自New England Biolabs（Ipswich,MAUSA）；5-二氟-4-羟基苄基咪唑烷酮（DFHBI-1T）购自Lucerna（美国布鲁克林）；细菌总RNA分离试剂盒购自上海生工生物技术有限公司；所有溶液采用分子生物级水（美国纽约康宁）配制。

表1 核苷酸序列表Table 1 Oligonucleotide sequences

美国伯腾Biotek Synergy H1多功能酶标仪；美国SCILOGEX（赛洛捷克）D3024R台式高速冷冻型微量离心机；上海一恒THZ-100恒温培养摇床。

1.2 实验方法

1.2.1 细菌培养及核酸提取

所有菌株分别在NB培养基中过夜培养得到菌液，梯度稀释后取适宜的3个连续梯度稀释液进行涂布平板计数。同时取1 mL不同浓度培养菌液4 ℃，12000 r/min离心10 min，弃上清，用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS，0.1 M，pH=7.4）洗涤沉淀，用细菌总RNA分离试剂盒提取纯化总RNA。所有RNA在进一步分析前保存在-80 ℃。

1.2.2 Broccoli适配体和crRNA的制备

50 μL反应体系中包含5 μL 10×phi 29聚合酶缓冲液，5 μL L-Broccoli（10 μM），5 μL启动子（promoter）（10 μM），90 ℃变性3 min，室温反应30 min；加入0.3 μL phi 29 DNA聚合酶（10 U/μL）和1 μL dNTPs（dATP，dGTP，dCTP和dTTP分别为10 mM），30 ℃孵育30 min，孵育使其延伸形成双链；再加入10 μL 5×转录缓冲液，1 μL T7 RNA聚合酶（20 U/μL），2 μL rNTPs（ATP，GTP，CTP和TTP分别为25 mM）和20.7 μL水，37 ℃孵育6 h，转录结束后，加入2 μL DNase I在37 ℃下4 h去除DNA模板，然后在75 ℃灭活15 min，得到Broccoli适配体。分子识别探针crRNA的制备方法同上。

1.2.3 靶标RNA的检测

取2.2中制备得到的Broccoli适配体4 μL（50 μM），crRNA 4 μL（1.5 μM），加入0.3 μL Cas 13（10 μM），4 μL 10×Cas 13 buffer，4 μL DFHBI-1T（100 μM）以及4 μL不同浓度的靶标RNA，加水至反应总体系为40 μL，37 ℃孵育30 min，检测荧光。其中激发波长为468 nm，发射波长范围498～650 nm，检测步长2 nm，记录不同活菌浓度下的荧光值。

1.2.4 特异性检测

每40 μL反应体系包括0.3 μL Cas 13a（10 μM）、10×Cas 13 buffer、4 μL Broccoli适配体（50 μM）、4 μL crRNA、4 μL DFHBI-1T（100 μM），分别加入2.2中提取的不同细菌RNA，混匀，37 ℃孵育30 min，检测荧光。

1.2.5 牛奶样品中单增李斯特活菌的检测

将单增李斯特菌接种至液体培养基过夜，将培养液用生理盐水进行梯度稀释，采用平板计数。然后取1 mL稀释菌液接种到9 mL牛奶中，将污染的牛奶4 ℃，12000 r/min离心20 min，弃上清[20]，用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS，0.1 M，pH=7.4）洗涤沉淀，用细菌总RNA分离试剂盒提取纯化总RNA，检测样品中RNA方法如1.2.3所述。

1.2.6 数据处理

每个样品设3个平行，测定结果以平均值±标准差表示。采用Origin 9.0作图。

2 结果与讨论

2.1 检测原理

检测原理如图1所示，靶标RNA仅存在于活菌中，死菌中RNA会迅速降解，根据靶标RNA的序列设计crRNA，其中crRNA包括向导序列和锚定序列。依赖锚定序列，crRNA可识别并结合Cas13形成Cas13-crRNA复合物，令crRNA的向导序列与靶标RNA反向互补，当样品中存在靶标RNA时，其通过碱基互补配对与Cas13-crRNA复合物结合，Cas13的非特异性RNase活性被激活，可切割无关的单链RNA（ssRNA）[21]。我们引入Broccoli适配体作为信号探针监测CRISPR-Cas13的激活状态，一旦Broccoli适配体被剪切,其结构遭到破坏，将无法结合并打开DFHBI-1T染料的荧光，产生荧光淬灭。因此通过Broccoli/DFHBI-1T复合物的荧光强度可以指示靶标RNA的存在，进而实现对单增李斯特活菌的快速检测。

图1 检测原理图Fig.1 Schematic illustration of CRISPR-Cas13 for detection of L.monocytogenes

首先对Broccoli/DFHBI-1T的荧光指示作用进行验证，结果如图2所示。自由状态下DFHBI-1T染料荧光信号微弱（对照组1），加入crRNA后荧光值无明显变化（对照组2），但加入Broccoli适配体后（对照组3），荧光强度从214激增至16386，表明Broccoli适配体可特异性结合并打开DFHBI-1T染料，形成Broccoli/DFHBI-1T复合物，发射强烈的荧光信号，与文献报道一致[22]。并且Broccoli适配体可以通过体外转录和扩增，扩增速率与PCR相当，允许等温扩增[23]。当加入Cas13和crRNA，荧光信号无明显变化（对照组5）。其次对CRISPR-Cas13的信号识别能力进行验证，当加入一段与crRNA部分互补的单链RNA(cRNA)，Cas13的非特异性RNase活性被激活，剪切Broccoli适配体产生荧光淬灭（对照组4）。当加入单增李斯特菌的RNA时，荧光强度减弱（从15706降至6496），说明靶标RNA可以激活Cas 13的剪切活性，进而剪切非靶标Broccoli适配体。

图2 原理验证图Fig.2 Validation of CRISPR-Cas13 assays for L.monocytogenes detection

2.2 实验条件优化

为了扩大该检测方法的信噪比，对实验条件进行进一步优化。首先根据单增李斯特菌16s rRNA片段，设计了不同的L-crRNA序列，并应用Primer-BLAST进行比对，筛选得到10条序列，再通过体外转录得到crRNA，结果如图3a所示，T8序列可特异性结合靶标RNA，激活Cas蛋白的剪切活性，信噪比为2.25，优化的L-crRNA的核苷酸序列如表1所示。此外，crRNA的缺乏或丰富导致信噪比降低[15]，因此对crRNA与Cas 13的比例进行优化，保持Cas13浓度为100 nM，Cas13：crRNA比值范围为1:1～3:1。结果表明，当Cas 13a和crRNA浓度为2:1时时，信噪比最大为3.32(图3b)。

图3 CRISPR-Cas13体系实验优化Fig.3 Optimization of CRISPR-Cas13 based assay

2.3 线性范围与检出限

为验证CRISPR-Ca13对单增李斯特菌检测的灵敏度。以系列单增李斯特菌菌液浓度为横坐标（0，2.3×10、2.3×102、2.3×103、2.3×104、2.3×105、2.3×106、2.3×107CFU/mL），以该浓度下的荧光值为纵坐标绘制标准曲线。如图4，荧光强度随着单增李斯特菌浓度的增加而降低，线性检测范围为2.3×102～ 2.3×106，拟合线性方程为y=-2415.2x+21854，R²= 0.9953，LOD（最低检测限）=148 CFU/mL。由于检测对象为RNA，提取方法以及RNA易降解的特性[24]，且未进行核酸扩增，导致该检测方法检测限略高。相比较利用RNA检测单增李斯特菌的其他方法，周振森等[25]以RAN检测为模板，利用Opti Gene Genie便携式仪器和反转录LAMP扩增，检出限为10 CFU/mL，但该法需要特定仪器，不适用于现场检测。徐匆等[26]在此基础上进行改进，以HNB作为指示剂，对单增李斯特菌的RNA进行反转录及环介导等温扩增，建立一种单增李斯特菌的RT-LAMP-HNB检测方法，可直接依据颜色变化判读结果。Ma CC等[27]建立一种基于RNA检测的RTLAMP方法，可用于检测鲜切水果和蔬菜中的活单增李斯特活菌，检测限低至1 CFU/mL。但由于实验过程中的污染及人员操作，LAMP方法的超灵敏性有时仍会导致假阳性结果。此外，LAMP还需要4至6个引物，相比其他等温扩增方法，引物设计更为复杂[28]，且对于反应温度有严格要求。因此，基于CRISPRCas13检测单增李斯特菌的方法，无需逆转录和核酸扩增，可实现对单增李斯特菌的快速、定量检测。

图4 单增李斯特菌的定量检测Fig.4 The relationship between [L.monocytogenes] and fluorescence response of CRISPR-Cas13 based array

2.4 特异性

为了验证该检测方法的特异性，本实验选取了食品中危害较大的三种食源性致病菌进行特异性实验。实验结果如图5所示，单增李斯特菌的crRNA序列对单增李斯特菌具有很强的识别能力，加入靶标RNA可特异性结合crRNA，激活Cas13的酶切活性造成荧光猝灭，荧光值降低。相反，加入沙门氏菌、大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌时，荧光值几乎无差异，未达到荧光淬灭的效果。表明该检测方法对单增李斯特菌具有较好的特异性。

图5 特异性分析Fig.5 Specificity test of L.monocytogenes detection

2.5 实际样品检测

为了验证该检测方法在食品检测中的可行性，本实验选取牛奶样品进行验证，结果如表2，样品加标回收率为95.15%～97.99%，表明该方法能实现复杂组分的食品基质中单增李斯特菌的准确、快速检测。

表2 牛奶样品中单增李斯特菌的检测Table 2 Determination of L.monocytogenes spiked in the milk (n=3)

3 结论

本实验结合CRISPR-Cas13作为信号识别元件，Broccoli适配体为信号探针，可对单增李斯特菌特异性识别，无需任何富集或平板培养过程，可在30 s完成对于单增李斯特活菌的识别与检测，检出限为148 CFU/mL。该方法无逆转录、无核酸扩增和核酸标记，识别和扩增皆可在恒温条件进行，降低了对于人员和精准控温设备的要求，适用于单增李斯特菌的现场检测，且直接检测致病菌RNA可有效避免死菌对实验结果的干扰。由于CRISPR-Cas13系统的可编程性，该检测可针对不同细菌设计crRNA的向导序列，具有较强的特异性和灵敏度，实现对不同的细菌的快速检测，为建立食品中快速和现场检测致病菌提供一种通用检测方案。