苦瓜功能稻米的淀粉理化特性分析

阳永建 袁 洁 陶湘林 何 艳 唐汉军

(1.湖南大学隆平分院，湖南 长沙 410125；2.湖南省农业科学院农产品加工所，湖南 长沙 410125)

随着健康产业的发展，普通食品功能化和功能食品主食化成为一个重要趋势[1]，作为重要主食的水稻育种战略也随时代的发展而变化，功能稻作为育种的一个重要方向，近年取得了丰硕的成果，如高直链淀粉[2]、高γ-氨基丁酸(GABA)[3]、抗高血压[4]、抗氧化[5-6]、抗过敏[7]、巨胚[8]等水稻品种相继问世。课题组前期采用花粉管通道法将苦瓜DNA导入籼稻，获得农艺性稳定遗传的子代(2017年农业部审定，品种名：早优517)，并证明苦瓜DNA片断成功整合进子代DNA中，且生理活性的主要目标物质皂苷等成分在胚乳中显著表达，但关于苦瓜DNA的导入对水稻品质的影响尚未明确，尤其是苦瓜DNA的导入对水稻淀粉精细结构的影响还需进一步研究。研究拟针对导入苦瓜基因的功能稻早优517(D9)，系统分析D9和受体(RT)胚乳淀粉的颗粒形态、粒径分布、结晶结构、糊化、凝胶质构和分子组成等特性，以期为中国功能稻的加工及应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 稻谷样品

苦瓜功能稻早优517成熟稻谷(试验编号D9、2018年、湖南)和受体成熟稻谷(试验编号RT、2018年、湖南)：湖南省水稻研究所何登骥研究员提供。稻谷样品种植在4片相连的水田，总面积约0.67 hm2，其中一片种植RT，其他3片田种植D9。每片田的稻谷分别收获，分别随机取稻谷样品约10 kg。晒干至适当含水量后，分别采用砻谷机去壳的糙米作为试验材料。

1.1.2 主要试剂

盐酸、硫酸：优级纯，国药集团化学试剂有限公司；

氢氧化钠、乙醇、正戊醇、乙醚、二甲基亚砜(DMSO)、碘化钾：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 主要仪器

扫描电子显微镜(SEM)：S-4800型，日本Hitachi公司；

激光粒度分析仪：LS-POP(6)型，珠海欧美克仪器有限公司；

X射线衍射仪：D8 Advance型，德国Bruker公司；

傅里叶红外光谱分析仪(FTIR)：Nexus 470型，美国梅特勤公司；

差示扫描量热计(DSC)：Q2000型，美国TA公司；

快速黏度分析仪(RVA)：Super4型，澳大利亚Newport Scientific公司；

质构分析仪：CT3型，美国Brookfield公司；

砻谷机：FC2K-Y型，株式会社山本制作所。

1.2 试验方法

1.2.1 淀粉样品制备 稻米胚乳淀粉的样本制备采用实验室常用的碱—醇提取法[9]。称取样品200 g，在4 ℃水浸泡24 h后，经磨浆过筛(120目)，离心(5 000×g，5 min，4 ℃)收集湿淀粉。加湿淀粉体积的4倍氢氧化钠溶液(0.1 mg/100 mL)，4 ℃下搅拌2 h以上，离心(5 000×g，5 min，4 ℃)收集湿淀粉，此处理重复3次后用0.1 mol/L的HCl溶液调节pH值至中性。湿淀粉在4倍体积去离子水中充分分散，加入正戊醇100 mL，激烈搅拌2 h以上，然后静止12 h以上，除去醇层，重复此步骤至醇液层透明为止。过400目筛后，离心(5 000×g，5 min，4 ℃)收集湿淀粉。用G4砂芯过滤器充分抽滤，依次加适量无水乙醇3次、乙醚3次进行洗涤，充分抽干淀粉后，于40 ℃下挥发残余乙醚。作为颗粒淀粉样品在干燥器中保存备用。

取上述颗粒淀粉样品约1 g，加10 mL DMSO，待充分糊化后加入95%乙醇50 mL，搅匀后离心(5 000×g，10 min)收集淀粉。此步骤重复2次。然后在G4砂芯过滤器上抽滤收集淀粉，并依次加入适量无水乙醇3次、乙醚3次进行洗涤，充分抽干后，于40 ℃下挥发残余乙醚。作为高纯度脱脂淀粉样品在干燥器中保存备用。

1.2.2 SEM观察 采用Bhat等[10]的方法处理样本后，采用扫描电子显微镜进行观察。

1.2.3 粒度分析 参照陶湘林等[11]的方法，采用激光粒度分析仪进行分析，每个样品重复测定3次。

1.2.4 结晶结构分析 参照Mir等[12]的方法，采用粉末X射线衍射仪进行分析，每个样品重复测定3次。

1.2.5 FTIR分析 根据满建民等[13]的方法，采用傅里叶红外光谱分析仪进行分析，每个样品重复测定3次。

1.2.6 DSC分析 参照陶湘林等[11]的方法，采用差示扫描量热计进行分析，每个样品重复测定3次。

1.2.7 RVA分析 参照Zhu等[14]的方法，采用快速黏度分析仪分析，每个样品重复测定3次。

1.2.8 膨胀势测定 根据Tang等[9]的方法测定淀粉膨胀势，每个样品重复测定3次。

1.2.9 凝胶质构分析 针对上述膨胀势测定用获得的淀粉凝胶，采用质构分析仪进行质构分析，选用直径2 mm圆柱形不锈钢探头TA10，采用TPA分析模式，探头压缩速度为0.5 mm/s，压缩距离为3 mm，每个样品重复测定10次。

1.2.10 淀粉—碘溶液可见光谱分析 根据李林静等[15]的方法测定，并基于680 nm碘蓝值计算淀粉的表观直链淀粉含量，每个样品重复测定3次。

1.3 数据统计分析

所有数据均采用Excel 2010和Origin 2018软件进行统计分析处理。

2 结果与分析

2.1 淀粉颗粒的形态与大小

D9和RT淀粉颗粒形态与大小，在SEM的观察中(图1)未见明显的差异，均是典型的水稻淀粉形态。两者的淀粉颗粒均为表面光滑的不规则多面体，平均大小约为5 μm。通过激光粒度仪分析，淀粉颗粒的体积分布图谱几乎是重叠在一起(图2)，对数据分析发现(表1)，D9和RT的平均粒径均为5.5 μm，3～9 μm的中颗粒体积百分比分别为93.2%和92.3%，D9和RT无显著差异。但D9和RT在3 μm以下小颗粒体积百分比分别为2.7% 和2.4%，而9 μm以上的大颗粒体积百分比分别为4.2%和5.3%，D9和RT有显著差异。

表1 淀粉粒径的体积百分比†Table 1 Volume percentage of starch particle size (n=3)

图1 淀粉颗粒形态SEM观察Figure 1 SEM observation of starch granule morphology

图2 淀粉的粒度分布图谱Figure 2 Particle size distribution map of starch

说明苦瓜DNA的导入可一定程度地干预籼稻淀粉颗粒形态的相关基因表达，导致淀粉颗粒的粒径组成发生变化。

2.2 淀粉颗粒的分子有序性

淀粉颗粒的广角X射线衍射图谱如图3所示，主峰的位置主要分布在13°～25°，在16°～19°有特征偶极峰，在20°左右观察到源于直链淀粉—脂肪的单螺旋结构形成的小峰，D9和RT均属典型的谷物类A型结晶淀粉[16]。淀粉的结晶区是由支链淀粉的双螺旋结构规则排列形成[17]，D9淀粉的相对结晶度为37.75%，RT的相对结晶度为36.14%，统计上有显著差异(表2)。

图3 淀粉颗粒的广角X射线衍射图谱Figure 3 Wide angle X-ray diffraction patterns of starch granules

D9与RT淀粉的傅里叶变换红外光谱如图4所示，主要差异表现在1 050～950 cm-1波数区间，参照满建民等[13]的方法，测量波数1 045，1 022，995 cm-1各峰顶点至基线的高度(峰强度)，计算出1 045 cm-1/1 022 cm-1和1 022 cm-1/995 cm-1的峰强度比值(表2)，D9淀粉分别为0.67和1.66，RT淀粉分别为0.60和1.18，D9与RT之间均有显著差异，表明D9淀粉颗粒的分子有序化程度更高[13]，与相对结晶度的结果一致。

表2 淀粉颗粒的分子有序性†Table 2 The molecular ordering of starch granules (n=3)

图4 淀粉颗粒的FTIR图谱Figure 4 The FTIR spectra of starch granules

说明苦瓜DNA的导入不仅对籼米淀粉颗粒形态的基因表达有一定程度的干预，同时对淀粉颗粒组织结构的形成机制产生实质影响。

2.3 淀粉颗粒的糊化特性

DSC图谱显示(图5)，D9和RT淀粉的结晶结构融解，分子完全变为无序状态的温度区间存在显著性差异。RVA图谱也表现了显著不同(图6)。DSC和RVA分析的数据列于表3。DSC分析的起糊温度、峰温度和终结温度，D9分别为65.5，71.3，78.2 ℃，糊化温度范围12.7 ℃；RT分别为77.8，81.8，86.7 ℃，糊化温度范围9.8 ℃。但D9的糊化焓值为10.1 J/g，显著高于RT的8.5 J/g。RVA分析，D9到达最高黏度的时间为4.4 min，比RT快0.6 min，获得的糊化温度分别为74.7，82.4 ℃，与DSC的分析结果一致。另外，D9的最高黏度、最低黏度、崩解值和终黏度分别为2 683.0，1 074.0，1 609.0，1 499.50 mPa·s，显著高于RT的各指标值。但D9的回生值为425.5 mPa·s，显著低于RT的463.5 mPa·s。从温度的视角，D9淀粉较易糊化，但较难老化。从分子秩序和糊化特性的所有指标值推断，D9淀粉的支链分子含量较高，分子量较大，分支较多而链长较短[14,17-19]，虽然形成的结晶区相对较大，但结晶结构强度较低，致使热稳定性较差。同时可能与D9淀粉小颗粒相对较多，大颗粒相对较少也有一定关系[17,19]。

表3 淀粉颗粒的糊化特性†Table 3 The gelatinization characteristics of starch granules(n=3)

图5 淀粉颗粒的DSC图谱Figure 5 The DSC spectrum of starch granules

图6 淀粉的RVA图谱Figure 6 The RVA map of starches

从上述分子秩序和糊化特性的结果可推断，D9稻米煮熟性较好且米饭老化较慢，作为口粮用的加工品质等得到一定程度提升。

2.4 淀粉的凝胶特性

淀粉的凝胶特性如表4所示。D9的膨胀势为20.01 g/g，显著高于RT的18.62 g/g。D9凝胶质构指标的硬度、黏性、弹性和咀嚼性等均高于RT，而内聚力和黏着性等均低于RT。这些结果支持D9淀粉的支链分子含量较高，分子量较大，分支较多而链长较短的推断[19]。但除弹性指标外，D9和RT的各单项指标之间统计上无显著性差异，可能是质构测量样品平行数量较少，同时使用的测量探头直径太小，获得的数据少而偏差值太大所致，在今后的测量中应改进。

表4 淀粉的凝胶特性†Table 4 The gel properties of starches

结果表明D9稻米因蒸煮熟化后的弹性增加，与原受体稻米比较，口感品质可能更偏向粳稻米的质感。

2.5 淀粉的分子及组成特性

淀粉分子与碘分子可形成包含复合物，使溶液呈蓝色。D9和RT吸收光谱存在显著差异(图7)，在550～800 nm范围内D9的吸光度均低于RT。如表5所示，最大吸收波长(λmax)，D9为561 nm，RT为581 nm。波长680 nm的蓝值(BV680 nm)，D9为0.16，RT为0.20。基于BV680 nm计算的表观直链淀粉质量分数，D9为13.33%，显著低于RT的16.47%。

表5 淀粉的分子及组成特性†Table 5 The molecular and compositional properties of starches (n=3)

图7 淀粉—碘溶液的可见光吸收图谱Figure 7 The visible light absorption spectrum of starch iodine solution

这些结果表明，D9不仅直链淀粉含量较低，且支链分子的链长较短[17,19]。苦瓜DNA的导入引起了受体的淀粉生物合成机制变化，D9淀粉的品质提升主要是基于淀粉分子水平的变化。

3 结论

研究将导入苦瓜DNA水稻品种(早优517)胚乳淀粉的颗粒形态、粒径分布、结晶结构、糊化、凝胶质构和分子组成等特性与受体进行了比较。早优517淀粉颗粒组织的分子秩序较高，表现了较大的最高黏度、最低黏度、崩解值、终黏度、膨胀势和凝胶弹性值，而热稳定性、凝胶回生值等指标较小。这些理化特性的差异，是源于较小的直链淀粉含量、最大吸收波长和碘蓝值等指标。导入苦瓜DNA引起了淀粉分子组成和结构的显著变化。推断：早优517作为口粮用米的场合，食味品质优于受体。

远缘植物DNA导入，可使籼稻获得植物生理活性成分的显著表达，同时对稻米淀粉的生物合成机制产生实质性改变，这些改变包含有利于食味品质改善的良性机制。但期望进一步打破各研究领域间的无形壁垒，健全多领域合作攻关机制，广泛共享育种科研人员掌握的育种资源，加快淀粉分子结构与理化性质之间的数量关系，以及淀粉生物合成机制的研究进展。