女性生殖道念珠菌病病原体检测方法探讨

杜 笠，杜秋蓉，刘祥琴，姜 伟

(1.四川天府新区人民医院检验医学中心，四川 成都 610213；2.成都中医药大学附属医院检验科，四川 成都 610075；3.四川省医学科学院·四川省人民医院检验科，四川 成都 610072)

女性生殖道念珠菌病是念珠菌(白念珠菌和非白念珠菌)引起的女性生殖道感染性疾病[1]。研究显示，病原菌是以白念珠菌占主要地位，其他的非白念珠菌(光滑念珠菌、热带念珠菌等)占少数[2]。由于近年广谱抗生素、肾上腺皮质激素、免疫抑制剂等的大量使用，发病率呈明显上升趋势。随着年龄的增加，身体机能下降，导致体内菌群失衡，增加了念珠菌等病原菌感染的风险[3]。加上非处方抗真菌药物使用，造成不规范的治疗，以及环境因素等，对女性生殖道念珠菌病的诊断与治疗造成不利影响[4]。因此，采取有效、准确的方法对患者的阴道分泌物进行检验以确定感染程度并明确诊断有利于患者的治疗，对念珠菌的致病性、预防和监测具有其重要意义。本文采用直接真菌涂片镜检法、实时荧光PCR定性法、念珠菌显色培养法对门诊高度怀疑阴道念珠菌病就诊者阴道分泌物标本640例进行检测，并对结果进行对比分析，以寻找更好的、有利于临床的检验方法，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料2018年3月1日至2019年11月29日天府新区人民医院、四川省人民医院和成都中医药大学附属医院妇科门诊就诊的高度怀疑阴道念珠菌病的阴道分泌物标本640例，将棉拭子上的阴道分泌物标本溶解加入无菌生理盐水的专用管，充分混匀分装一式三份，分别用做直接真菌涂片镜检、实时荧光PCR定性检测和念珠菌显色培养。

1.2 仪器、试剂与方法

1.2.1直接真菌涂片镜检法 ①仪器：日本OLYMPUS双目显微镜。②试剂：浓度为5%的氢氧化钠溶液。③方法：将涂有阴道分泌物载玻片滴加浓度为5%的氢氧化钠溶液两滴，涂抹均匀后放在显微镜下进行检查，看是否有霉菌孢子和/或菌丝，若有为阳性结果。

1.2.2实时荧光PCR定性法 ①仪器：美国ABI 7500型实时荧光PCR仪、eppendorf生产的Centrifuge 5430离心机、恒温金属浴、漩涡震荡器、生物安全柜等。②试剂：厦门泰普生物科学有限公司生产的白色念珠菌、光滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌三种核酸检测试剂盒。③方法：向装有棉拭子标本的采样容器中加入1 ml生理盐水，充分振荡混匀后，转移到1.5 ml离心管中，离心12000 r/5 min，去除上清，加入600 μl已配制好的清洗液B(试剂盒中的浓缩清洗液B与灭菌注射用水按1∶9的比例配制，放置4 ℃冰箱备用)，充分震荡混匀，离心12000 r/5 min，去除上清(此洗涤步骤重复三次)，加100 μl的DNA提取液重悬，混匀，再加入试剂盒中的提取固形物，强力振荡至少15 min，离心10 s，将离心管放入到恒温金属浴中加热裂解细胞15 min，取出，放入到-20 ℃的冰箱进行冰浴15～20 min，取出，离心12000r/2 min，取上清5 μl加入到反应体系中(反应体系按照试剂盒说明书进行配制：计算需要进行的反应管数n后，n×44.3 μl GBS-PCR混合液，n×0.5 μl Taq DNA聚合酶，n×0.2 μl UNG酶，n×1 μl内对照加入一个离心管并振荡混匀，离心10 s后，分装至n个PCR扩增管，每管45 μl，放4 ℃冰箱备用)，同时加白色念珠菌(CA)、光滑假丝酵母菌(CG)和热带假丝酵母菌(CT)的阴性及阳性对照样品，进行扩增。编辑样本信息并按下列循环参数进行扩增反应：Stage 1设37 ℃-2 min；Stage 2设94 ℃-2 min；Stage 3设94 ℃-2 sec，55 ℃-45 sec，循环10次；Stage 4设94 ℃-2 sec，55 ℃-45 sec(在此步收集荧光信号)，循环30次。CA/CG/CT-DNA荧光素：FAM，内参照荧光素：Texas Red。结果判读：读FAM荧光素Ct值=30或者“Undet.”，Texas Red荧光素Ct值<30，扩增曲线呈典型S型，为CA/CG/CT-DNA阴性结果；当CA/CG/CT-DNA的FAM荧光素Ct值≤23，扩增曲线呈典型S型，Texas Red荧光素Ct值≤30，为CA/CG/CT-DNA阳性结果。

1.2.3念珠菌显色培养法 ①仪器：二氧化碳培养箱。②试剂：加氯霉素的沙保罗培养基、念珠菌显色培养基。③方法：在生物安全柜中，用一次性接种环或棉签以无菌方法取阴道分泌物标本直接划线接种于含氯霉素的沙保罗培养基，然后置于35 ℃10%二氧化碳培养箱进行培养，2～3天观察培养结果，若见奶油状、表面光滑的菌落，并带有酵母气味为培养阳性。然后从含氯霉素的真菌(沙保罗)培养基上挑取菌落，接种于念珠菌显色培养基，于35 ℃10%二氧化碳的真菌培养箱放置 48 小时，观察颜色变化，若出现绿色或翠绿色菌落，则判定为CA；若出现蓝灰色或铁蓝色菌落，则判定为CT；若出现白色菌落，则判定为CG或其他酵母菌。

1.3 统计学方法采用SPSS 22.0软件分析数据。计数资料比较采用卡方检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

640例标本经直接真菌涂片镜检阳性198例(阳性率30.9%)；实时荧光PCR定性结果：三种念珠菌阳性为296例(阳性率46.3%)，包括白色念珠菌(CA)234例、光滑假丝酵母菌(CG)39例、热带假丝酵母菌(CT)23例，其中CA合并CT共5例。念珠菌显色培养法检测结果：三种念珠菌阳性为287例(阳性率44.8%)，包括CA共229例、CG共36例、CT共22例，CA合并CT共3例。

三种方法阳性率比较：直接真菌涂片法低于显色培养法和实时荧光PCR定性(χ2分别为31.66，25.30，P<0.05)，实时荧光PCR定性法与显色培养法比较，差异无统计学意义(P>0.05)。以显色培养法为金标准，直接真菌涂片法对生殖道念珠菌病诊断的敏感度为68.99%，特异度为100%，阳性预测值为100%，阴性预测值为79.64%，约登指数为0.69。实时荧光PCR定性法对生殖道念珠菌病诊断的敏感度为100%，特异度为97.45%，阳性预测值为96.96%，阴性预测值为100%，约登指数为0.97。见表1。

表1 直接真菌涂片镜检法、实时荧光PCR定性法和念珠菌显色培养法检测结果

3 讨论

有70%的正常健康女性生殖道内存在着念珠菌[5]，其感染已成为引起女性生殖道疾病的第二大病因，其发病率仅次于细菌性阴道炎[1，6]，多数研究显示，任何破坏阴道局部环境稳定的因素，都可能导致念珠菌阴道病的发生[7]。念珠菌阴道病作为临床妇科的常见病，且常有比较高的复发率[1，8，9]，该病的症状主要是：外阴瘙痒，严重时坐卧不宁，非常痛苦，尤其是对反复发作的患者，常常承受着巨大的身心健康方面的压力。因此，快速、准确的检测结果对诊断和治疗该病十分重要。

本研究结果显示，涂片镜检法为阴性的标本，用荧光PCR定性方法检测，结果为阳性，这种结果存在的原因：一是直接真菌涂片镜检灵敏度低；二是人为因素，在门诊大量标本的压力下，观察视野不足；三是涂片标本太少；四是一些慢性或者经过治疗的患者，本身含菌量就少，镜检不易发现。同时，涂片镜检法为阳性的8份标本，而荧光PCR定性方法检测为阴性，这种情况可能是由于该8份标本所感染的类型并非CA、CG、CT这三种念珠菌，故直接真菌涂片镜检法和荧光PCR定性法检测结果不一致。

另外，有5例标本荧光PCR定性法检测为CA合并CT感染，经念珠菌显色培养法检出3例CA合并CT感染，其余为单一念珠菌感染。经分析，两种方法检测结果出现差异的原因如下：①荧光PCR定性方法本身的局限是病原体死亡后的核酸仍能通过PCR扩增检测到，但无法判定是否死菌还是活菌，从而得到两种不同念珠菌阳性的结果。②用念珠菌显色培养法检测标本，标本中劣势菌菌量少，被优势菌抑制，导致只分离到一种念珠菌阳性的结果。

本文对采用直接真菌涂片镜检法、实时荧光PCR定性法、念珠菌显色培养法三种方法检测阴道分泌物的结果进行了对比分析，从结果来看，直接真菌涂片镜检法操作简便、费用低廉，报告及时，但灵敏度低，易造成漏检，尤其不适合慢性及治疗过程的患者，同时不能区分念珠菌的种类。真菌培养法(显色法)灵敏度和特异度高，其鉴定和药敏试验结果对临床针对性用药有着重要的指导意义，但操作繁琐，需要培养2～3天，不能为临床提供早期诊断和治疗的依据。当实验室的环境条件、培养箱CO2浓度及湿度、温度等不能保证时，培养结果会产生较大误差[10]。荧光PCR定性法具有操作方便、快速、灵敏和特异强等优点，同时可以进行真菌分类，在具有核酸检测平台的实验室应推广应用，虽然荧光PCR定性法还未覆盖所有念珠菌，但目前包含了三种最常见的念珠菌，从本次探索中发现与大家公认的培养法比较，具有高度一致性。

综上所述，应综合患者及医院实际情况来选用合适的检测法。最好在具有核酸检测条件的实验室首推荧光PCR定性法来检测CA、CG、CT，为临床提供及时的病原学诊断和治疗依据。