小柴胡汤化裁方对AD 小鼠记忆认知能力及海马神经元形态的影响∗

陈 靖，王 卉△，刘晓丹，许欣竹，刘文俊，谢 鑫

1 辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847；2 中国中医药国际合作中心

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）又称老年痴呆症，是一种认知功能障碍及渐进性记忆障碍的神经系统退行性病变，其特征性病理主要标志是β淀粉样蛋白（amyloidβ-protein，Aβ）沉积形成的细胞外老年斑和由Tau蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经原纤维缠结（NFTs）及神经元丢失伴胶质细胞增生［1］。

相关研究［2-4］证实，有效心理干预可缓解高龄痴呆患者抑郁表现，改进各项生活功能。而情志不畅，气机升降失常，易生湿酿痰，导致经络失养，诱导发生AD，加重病情，小柴胡汤是调畅气机代表方剂，本研究观察疏肝理气，补肾填精的小柴胡汤化裁方对AD 小鼠水迷宫测试学习记忆能力和海马组织形态学的影响。

1 材料

1.1 动物SPF 级雄性昆明种小鼠（辽宁中医药大学动物实验中心提供）60 只，体质量20～30 g，SPF 级饲料喂养，自由饮水，温度20～25℃，湿度55%～65%。

1.2 药物尼莫地平（亚宝药业，国药准字H14022821，规格：20 mg×50 s）；小柴胡汤化裁方（柴胡40 g，黄芩15 g，人参15 g，半夏15 g，炙甘草10 g，生姜10 g，大枣4枚，肉苁蓉20 g，熟地黄20 g），适量水煎，大火煎沸后，再用小火煎20～30 min。头煎30 min，第二次煎煮20 min，合并两次药液，在室温条件下浓缩成含生药1 g/mL的药液备用。

1.3 试剂Aβ1-42（Sigma）；4%多聚甲醛（武汉博士德）；苏木素伊红（HE）染色试剂盒（Solarbio 公司，货号：G1120）。

1.4 设备Morris 水迷宫视频分析系统（成都泰盟公司）；DW-5 型脑立体定位仪（成都泰盟公司）；BX-50型光学显微镜（日本OLYMPUS公司）。

1.5 方法

1.5.1 造模及分组给药 将小鼠随机分为正常组、模型组、西药组及中药高、中、低剂量组，每组5 只。除正常组外，其他各组参考文献［5］制备AD小鼠模型，实验前将Aβ1-42用生理盐水稀释成5 μg/μL，放37℃恒温水浴锅中孵育7 天，老化呈凝聚丝状。各组小鼠用5%的水合氯醛麻醉，固定于脑立体定位仪上，常规消毒后，切开头皮，以双侧海马CA1 区为给药点，定位点位于前囟后2.3 mm，矢状缝两侧旁开1.8 mm，进针深度为颅骨表面向下2.0 mm。用微量进样器向每只小鼠双侧海马各注入5 μg/μL Aβ1-42。进针速度为1 mm/min，注射速度为1 μg/min，留针5 min后以同样速度缓慢拔出进样器。术后消毒缝皮，常规饲养。造模后7天开始给药，中药组灌胃小柴胡汤化裁方高（40 g/kg）、中（20 g/kg）、低（10 g/kg）剂量（按照人与小鼠体表面积比换算给药等效剂量），西药组灌胃尼莫地平15 mg/kg，正常组灌胃等体积生理盐水，每日1次，连续21天。

1.5.2 Morris 水迷宫实验 学习记忆检测：药物干预后采用Morris 水迷宫对小鼠进行行为学检测，测试内容包括第1～4 天的定位航行和第5天的空间探索。Morris 水迷宫装置为一直径为100 cm，高约70 cm的圆形桶，将第三象限设置为目标象限，象限中心放置逃生平台，距离液面以下2 cm。在整个实验期间位置保持不变。水池上方约2 m 处放置摄像机，自动釆集小鼠游泳图像，将所收集实验信号输入计算机，利用图像自动采集和分析系统对实验小鼠的运行轨迹、逃避潜伏期、各平台象限的游泳时间和路程等参数进行自动分析处理。定位航行：将小鼠面对池壁从1、2、3、4 象限分别缓慢放入水中，逃逸潜伏期以90 s计算，可人为将其拿到平台上并停留10 s 后，再从另一象限入水。第5 天进行空间探索实验，移去平台，小鼠从选定象限头朝池壁入水，记录小鼠90 s 内穿越原平台所在位置的次数。

1.5.3 HE 染色 取4%多聚甲醛固定的海马组织，固定组织脱水、透明，样本浸蜡包埋，石蜡包块切片，脱蜡处理，苏木精-伊红（HE）染色，观察AD小鼠海马组织形态。

1.6 统计学方法采用SPSS 23.0软件分析数据，计量资料以表示，采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 水迷宫实验结果各组逃避潜伏期随着训练天数的增加而逐渐下降，前3天各组无明显差异，第4天，与正常组比较，模型组潜伏期增加（P＜0.05），提示AD 小鼠出现空间学习障碍；与模型组比较，中药高剂量组和西药组潜伏期缩短（P＜0.05）。模型组小鼠穿越平台次数少于正常组（P＜0.05），说明痴呆小鼠记忆力下降；与模型组比较，中药各组痴呆小鼠穿越平台次数均不同程度增加，中药高剂量组和西药组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1、图1—2。

表1 各组小鼠水迷宫实验结果（）

表1 各组小鼠水迷宫实验结果（）

注：*表示与正常组比较，P＜0.05；#表示与模型组比较，P＜0.05

图1 小鼠逃避潜伏期

图2 小鼠空间探索次数

2.2 海马组织HE染色结果模型组小鼠海马神经细胞增加，锥体神经细胞带不完整，神经元丧失，部分为胶质细胞所取代。正常组细胞排列紧密，核染均匀，与模型组比较，中药高、中剂量组和西药组海马神经细胞形态及神经元丧失减轻，胶质细胞呈散在分布。见图3。

图3 海马组织HE染色结果（×200）

3 讨论

AD 是一种进行性、发病隐匿的神经系统性病变之一［6-9］，淀粉样蛋白沉积后诱导胶质细胞活化，神经元损伤，促进上调炎症反应［10］，并诱发学习记忆能力减退，病情呈进行性发展。相关研究显示，在AD 致病因素中，抑郁情绪高于50%［11］，据此，BENNETT 等［12］提出抑郁症可能是引发AD 的1项因素，此症状为AD的前驱病症。

AD 病因复杂，较常见的学说包括Aβ 毒性假说、胆碱能学说、炎症刺激反应学说、自由基损伤学说、Tau蛋白异常磷酸化等［13-15］。AD发病群体中抑郁症可能是重要致病危险因素，并且抑郁症症状在AD 临床诊断之前就已出现。抑郁症患者患AD 的发病率高于非抑郁症者［16］。AD 发病机理以肝气凝聚、髓海空虚、肾精缺乏为主。对于高龄者而言，肾精气虚，不能充分滋养髓海，反应性降低，神情木讷。诸多消极因素包括空虚、抑郁、生活压力等均会导致肝失疏泄，心理抑郁，经络受阻，长期以往导致瘀、湿、痰等的形成，无法充分滋养脑海，导致认知困难。

本研究以小柴胡汤为基础方化裁，可理气开郁，补肾填精，切中AD 病机。水迷宫实验显示，模型组小鼠潜伏期增加，跨越平台次数减少，中药尤其是高剂量干预小鼠潜伏期缩短，跨越平台次数增加，说明模型组小鼠学习记忆能力下降，而中药干预有效。海马区神经细胞HE 染色说明模型组小鼠符合AD 疾病发展规律，神经元缺失，细胞松散，导致负责学习记忆功能的海马组织受损伤，进而出现行为学变化，高剂量中药从AD 病机出发，能有效改善AD 小鼠学习记忆能力，保护海马神经元组织。