巴戟天-续断-益母草组药干预肾虚血瘀型多囊卵巢综合征网络药理学作用机制∗

袁仁智，肖卫琼，唐 鹏，康开彪，潘 文

1 甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050；2 甘肃省中医药研究院；3 邵阳学院

多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是影响女性最常见的内分泌紊乱疾病，在育龄女性中发病率约5%～20%，且呈不断上升趋势［1］。PCOS 主要包括月经周期紊乱、高雄激素血症和肥胖等临床症候群［1］。PCOS的发病机制及其相关症状虽有待解释，但症状和体征的异质性提示其发病因素多样［2］。有学者认为，PCOS 的发生不仅受遗传影响，也与下丘脑-垂体-卵巢轴调控功能紊乱、高胰岛素血症、肥胖、精神、心理、环境等因素密切相关［3］。西医主要通过抗雄激素、胰岛素增敏剂及促排卵药物干预，虽有一定疗效，但常伴有肿胀、胃痛、盆腔或下腹部痛等不良反应，严重时引发卵巢过度刺激综合征，出现头晕、恶心、呕吐、精神抑郁甚至导致卵巢早衰。中医药辨证论治的个性化方案在治疗PCOS 方面有独到之处。通过整理古今中医名家治疗PCOS 疾病或症状的方剂，运用中医传承辅助系统进行数据分析发现，中医治疗PCOS 证候中以肾虚血瘀型和肝郁肾虚型最多，肾、脾、肝脏功能失调是PCOS 主要病机，补虚和解郁是治疗PCOS 的根本方法，而补肾健脾、疏肝解郁、理气化痰、活血化瘀是治疗PCOS的主要思路［4］。

中药系统药理学数据库和分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）作为目前国内较为完善的草药成分靶点数据库，共收录了505 味草药的12 144 个活性成分、关键药物动力学性质、类药性、作用靶点、参与的通路及相关疾病，为中草药检索、新药开发和中医药基础理论的现代阐释提供了新手段和新方法。

本研究提取肾虚血瘀型方剂核心组药，采用网络药理学方法分析药物的化学成分、靶点和通路之间的关系，试图揭示中药治疗PCOS 的作用机制。

1 资料收集与分析方法选择

借助中国中医科学院研制的中医传承辅助平台（2.5版本）建立PCOS方剂数据库并进行数据挖掘［4］，数据库收集了130 位现代医家的352 个方剂，对其中的肾虚血瘀型方剂运用熵聚类法进行关联分析。

2 方法与结果

2.1 巴戟天-续断-益母草组药挖掘及其活性成分筛选和靶点预测进入自建的中医传承辅助平台PCOS 数据库，通过数据分析组方规律，获得肾虚血瘀型方剂25个，涉及药物96味。运用关联规则和熵聚类法发现，当支持度为6，置信度为0.6时，巴戟天-续断-益母草配伍概率较高。因此，选取巴戟天-续断-益母草为肾虚血瘀型PCOS 的核心组药进行网络药理学分析。

进入TCMSP 平台（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），选择Herb name，依次输入“Bajitian”“Xuduan”“Yimucao”，分别获得174 个、31 个和51 个化学成分，然后根据口服生物利用度（OB）和药物相似度（DL）进行筛选，设为OB≥30%，DL≥0.05，去重后得到巴戟天-续断-益母草活性化合物34个（巴戟天18个，续断6个，益母草8个，巴戟天和续断共有2 个）。同时在TCMSP 中获得34 个化合物的620 个潜在靶点（其中有6 个化合物无靶点），筛去重复项，整理得到140个靶点，见表1。

表1 巴戟天-续断-益母草组药活性化合物特征

2.2 药物与疾病共靶点及化合物-靶点网络NCBI是一个关于分子生物学、生物化学和遗传学知识的存储和分析的数据库。进入NCBI 基因数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov），以“polycystic ovarian syndrome”为关键词检索，选择种属“人类”，得到228个PCOS疾病基因靶点。

将巴戟天-续断-益母草组药与PCOS 疾病靶点分别录入Excel 建立文档，通过比对找到两者的共有靶点19 个，涉及化合物25 个，这些可能是PCOS 的主要作用靶点。将共靶点及其对应化合物数据导入Cytoscape 3.7.0 构建化合物-靶点（CT）网络，44 个节点代表化合物和靶点，86 条连线代表化合物和靶点的关系，每个靶点涉及的化合物均值为4.52，每个化合物涉及的靶点均值为3.44，涉及4 个及以上靶点的化合物有8 个，最多的有17个靶点。涉及5个及以上化合物的靶点有5 个，最多的涉及20 个化合物。这8 个化合物和5个靶点可能与PCOS关系最为密切，见表2、图1。

表2 巴戟天-续断-益母草组药与PCOS疾病共靶点

图1 化合物-靶点网络图（圆形代表化合物，三角形代表靶点）

2.3 共靶点蛋白互作网络药物作用既可以表现为直接与靶点结合和单一的信号通路，也可以是直接靶点和间接靶点共同调控等多靶点、多通路、多层次的复杂网络模式。因此通过蛋白之间的相互作用关系即PPI 网络可以进一步深入分析药物对PCOS的重要影响。进入String数据库，点击Multiple Proteins，输入19 个共靶点，种属“人类”，设置评分为0.4，网络边缘含义为“分子作用”，得到蛋白互作网络，节点数为19，边数为99，平均节点度为10.4，局部聚类系数为0.852。PPI 富集P值＜1.0e-16，这意味着蛋白质之间的相互作用较基因组中随机的一组相似大小的蛋白质所预期的更多，即蛋白质之间的活跃度较高，见图2。

图2 蛋白互作网络

2.4 靶点通路通过DAVID 数据库得到19 个共靶点的基因功能GO 富集1 048 条，KEGG 信号通路富集21条。其中细胞组成25个，主要包括细胞外空间、细胞外区域、分泌颗粒、细胞质囊泡、细胞内囊泡等；生物功能28 个，主要包括受体结合、细胞因子活性、类固醇激素受体活性、生长因子受体结合、脂质结合、转录因子活性、生长因子活性、氧化还原酶活性、受体调节剂活性、调节区DNA 结合、调节区核酸结合等；生物过程995 个，主要涉及对有机物的反应、细胞增殖、对脂质的反应、对含氧化合物的反应、对外部刺激的反应、生物合成过程的正调节、细胞凋亡、程序性细胞死亡、大分子生物合成、细胞内信号转导的正调节、对类固醇激素刺激的细胞反应、血管发育、单一生物代谢过程、趋化因子生物合成、细胞活化、血液循环、免疫效应过程和炎症反应等；信号途径主要有HIF-1信号通路、类风湿性关节炎、1 型糖尿病、炎症性肠病、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、NOD 样受体信号通路、PI3K-Akt 信号通路、癌症的途径、雌激素信号通路、胰岛素抵抗、卵母细胞减数分裂、Jak-STAT 信号通路、非酒精性脂肪性肝病、癌症中的转录失调、同种异体移植排斥反应、膀胱癌等；设置参数为FDR＜0.05，P＜0.05，获得GO 条目189 个，KEGG条目1条即HIF-1信号通路。21条信号通路富集结果采用OMICSHARE（http：//www.omicshare.com）在线工具作出泡泡图。同时借助Cytoscape 3.7.0构建靶点-通路网络，见表3—4、图3—5。

表3 预测靶点基因功能富集

表4 潜在靶点信号通路富集

图3 潜在靶点生物功能富集图

图4 预测靶点信号通路富集图

3 讨论

网络药理学是一门从生物网络角度研究疾病发生和发展过程，认识药物与机体的相互作用并指导新药发现的学科，在研究工具上，该学科借助高通量组学数据、分子网络数据以及计算机模拟分析，研究药物的作用机制和促进药物创新［5］。而中医的整体观念、辨证论治理论与网络药理学的系统动态观高度一致，因此，运用网络药理学方法研究中医复方的作用机制成为目前药理学研究的一个热点［6］。本研究通过数据挖掘找出了治疗肾虚血瘀型PCOS 的一组核心组药巴戟天-续断-益母草（B-X-Y），这3 味药是中医临床专家广泛使用的补肾活血药物。研究借助系统药理学、药代动力学和生物信息学方法确定组药的活性化合物及与PCOS相关的靶点和通路。

图5 靶点-通路网络图

通过TCMSP 平台的OB 和DL 筛选，获得巴戟天-续断-益母草的34 个化合物和140 个靶点，发现其中靶点最多的是槲皮素（87 个靶点）和山奈酚（55 个靶点），其次是β-谷甾醇、异鼠李素、花生四烯酸和蒽醌。可见，槲皮素和山奈酚是治疗PCOS 的主要化合物，这与LIU 等［7］研究二仙汤治疗PCOS 的结果一致，也与本项目前期研究菟丝子治疗肾虚血瘀型PCOS 的结果相吻合，不同之处在于LIU等［7］研究主要来自二仙汤当中的淫羊藿、知母和黄柏，本研究中槲皮素、山奈酚和异鼠李素（36 个靶点）、花生四烯酸（31 个靶点）均来源于益母草。槲皮素是一种植物多酚，除了在血小板聚集、脂质过氧化、毛细血管通透性、细胞摄取和自由基中的积极作用外，还具有抗炎、抗癌及抗病毒活性［8］。WANG 等［9］研究结果表明，槲皮素可抑制Toll样受体/NF-κB信号通路，改善PCOS大鼠模型中卵巢组织的炎症微环境。REZVAN 等［10］研究发现，在随机安慰剂对照的双盲试验中，口服槲皮素补充剂可增强AMPK 水平，改善PCOS 的代谢特征。山奈酚是一种膳食类黄酮，具有抗氧化、抗炎、抗细胞凋亡、抗癌、雌激素和抗雌激素活性［11］。其通过减弱炎症和细胞凋亡来调节MAPK 通路以防止IR 损伤［12］。异鼠李素属于黄酮类，分子式为C16H12O7，其作用广泛，有扩张冠脉、保护血管内皮及抗血栓、抗肿瘤细胞［13］、抗病毒［14］及减轻氧化应激、抗细胞凋亡［15］和抗炎［16］等作用。花生四烯酸是一种ω-6 多不饱和脂肪酸，为花生油中饱和的花生酸的相对物，具有酯化胆固醇、增加血管弹性、降低血液黏度，调节血细胞功能等一系列生理活性，对预防心血管疾病、糖尿病和肿瘤等具有重要作用。相关文献［17-18］报道糖异生的增加是2 型糖尿病基础状态下高血糖的一个重要因素，而吴勉云等［19］实验表明，花生四烯酸能显著降低糖异生两个关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和葡萄糖-6-磷酸酶的转录水平以及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的酶活性。来源于巴戟天的两种蒽醌：2-羟基-1，5-二甲氧基-6-（甲氧基甲基）-9，10-蒽醌和1，6-二羟基-5-甲氧基-2-（甲氧基甲基）-9，10-蒽醌，分别有31个靶点和29个靶点，两者的口服生物利用度较高，分别为95 和104。蒽醌类化合物是各种天然醌类化合物中数量最多的一类化合物，具有抗菌消炎［20］、抗病毒［21-23］、抗肿瘤［24-25］、利尿、活血［26］、降血脂［27］和增强免疫功能［28］等作用。β-谷甾醇的51 个靶点来源于巴戟天和续断。β-谷甾醇是植物甾醇类成分之一，属于四环三帖类化合物，有降胆固醇、止咳、祛痰及抑制肿瘤和修复组织作用。用于Ⅱ型高脂血症、动脉粥样硬化症和慢性气管炎，亦用于早期子宫颈癌及皮肤溃疡等［29］。由于巴戟天-续断-益母草组药中已知的化合物成分多达256 种，它们中可能有多种成分通过多种机制作用于多个靶标。

药靶网络和PCOS网络有19个重叠基因，富集于21 条通路。其中有5 个靶点富集的通路有HIF-1 信号通路、类风湿性关节炎、1 型糖尿病、炎症性肠病、TNF 信号通路，涉及基因12 个，根据其所涉通路依次排序为：IL-6（15 条）、IL1β（11 条）、IFNG（11 条）、INS（6 条）、CCL2（6 条）、IL-2（5 条）、VEGFA（5 条）、NOS3（4 条）、PPARG（3 条）、MMP2（3条）、AR（1 条）、HMOX1（1 条），结合蛋白互作网络关系（表2 和图3），得分前10 位的基因是IL-6、INS、VEGFA、NOS3、PPARG、MMP2、CCL2、IL1β、IL2和ESR2，因此IL-6、IL-1B、IFNG、INS、CCL2、IL2、VEGFA 等，可能是PCOS治疗中涉及的关键基因。如TNF主要由巨噬细胞分泌，并可诱导某些肿瘤细胞系的细胞死亡。CHEN 等［15］发现PCOS 患者血清TNF-α和AMH高表达，血清TNF-α和AMH水平与PCOS高度相关，可以作为预测PCOS 风险的诊断指标。FASSHAUER 等［30］发现TNF-α和胰岛素能上调脂肪细胞上IL-6表达，胡静等［31］研究发现IL-6主要与IR 有关，TNF-α 和IL-6 协同作用能加重PCOS病情的发生发展。TNF 信号通路和胰岛素抵抗与PCOS发生及发展密切相关已成为共知。最近的研究发现，NOD 样受体信号通路也对PCOS 产生影响。贺晶等［32］探讨促性腺释放激素激动剂辅助腹腔镜下卵巢巧克力囊肿剥离术对TNF-α和IL-6 水平的影响研究表明，该术不仅能提高妊娠率，还能降低NOD1、NOD2 的表达，下调血清NF-α和IL-6 水平，抑制患者体内炎症状态。

总之，巴戟天-续断-益母草组药治疗PCOS 是分子间协同作用的结果，通过干预分子网络、生物过程和通路来恢复机体平衡，具有多成分、多靶点的特点，其对PCOS 的治疗主要是通过补肾活血化瘀达到抗炎、抗肿瘤、调节血脂、促进微循环及改善胰岛素抵抗的目的，与现代医药治疗多囊卵巢综合征的作用机制相符合。