基于网络药理学探讨葶苈大枣泻肺汤治疗慢性心力衰竭的作用机制∗

冯思颖，吴威妮，褚庆民，邱艺俊，李思宁△

1 广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州 510000；2 广州中医药大学第一附属医院

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是各种心脏疾病的严重阶段或晚期阶段，由心脏结构改变或功能失常导致，常见症状有活动耐量下降、呼吸困难、咳嗽咳痰、难以平卧、双下肢水肿等。CHF 是临床常见的危急重症，根据心脏收缩/舒张功能障碍，可分为收缩性心力衰竭与舒张性心力衰竭，根据其不同临床表现，可分为左心力衰竭、右心力衰竭、全心力衰竭［1］。目前患有CHF 的人数处于上升阶段，且与年龄相关，患病率随年龄增长而增加［2］。有研究［3］表明，55 岁人群中30%的人会发生心力衰竭，其5 年生存率为35%，住院后1 年死亡率为25%。目前对于CHF 的治疗，主要控制基础病，口服β-受体阻滞剂、血管紧张素转化酶抑制剂/血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂、醛固酮拮抗剂等［1］，可有效控制心衰发展，但仍存在不良反应多、经济负担重的缺点。因此，发挥中药简、验、廉、便的作用显得尤为重要。

根据症状特点，可将CHF 归于中医“心衰病”“喘证”“心悸”“水肿”范畴。葶苈大枣泻肺汤出自《金匮要略》，可泻肺行水，下气平喘，是治疗CHF的常用方，越来越多的研究证实其疗效可靠［4-5］。但其作用机制尚不明确。通过网络药理学，可将药物作用从分子、细胞到组织和有机体水平揭示药物-基因-靶点-疾病之间的交互网络关系［6］。本研究基于网络药理学理论，预测葶苈大枣泻肺汤治疗CHF 的机制，以期为临床实践提供一定理论依据。

1 资料与方法

1.1 葶苈子、大枣活性成分获取中药系统药理学分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP）是一个大型数据整合平台，既可对多种中药进行活性成分分析及靶点获取，还可建立药物-靶点网络及药物-疾病网络，有助于揭示中草药的作用机制及中医理论本质［7］。在TCMSP 平台（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）分别以“葶苈子”“大枣”为检索词检索，获得其化学成分，限定其口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，类药性（drug likeness，DL）≥0.18，筛选出其活性成分。并通过Pubchem平台（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）检索出每一个活性成分的Canonical SMILES码。

1.2 活性成分作用靶点获取Swissarget Prediction 是一个用于生物活性小分子靶预测的网络平台，预测可在5 种生物中进行，可输入活性成分SMILES 进行检索［8］。将活性成分的Canonical SMILES 码输入SwissTargetPrediction数据库（http：//www.swisstargetpre-diction.ch/），限定物种为“Homo sapiens”，筛选出每个活性成分的关键靶点蛋白名称、基因名称等信息。

1.3 CHF 相关靶点获取以“chronic heart failure”为检索词，在GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）中搜索CHF的相关靶点。

1.4 药物-疾病交集靶点获取将葶苈子、大枣相关靶点信息及CHF 相关靶点信息导入FUNRICH软件，获得的交集靶点即为葶苈子、大枣作用于CHF的预测靶点，并制作Venn图。

1.5 构建中药活性成分-靶点网络使用Cytoscape 3.7.1 软件对中药活性成分-靶点网络进行分析，体现中药活性成分与药物-疾病共同靶点之间的相互联系，且根据化合物与靶点连接情况筛选出中药作用于CHF的关键化合物。

1.6 PPI 网络的构建及关键靶点筛选STRING数据库可用于分析生物的蛋白质-蛋白质关联［9］，将获得的药物与疾病共同靶点信息输入STRING数据库（https：//string-db.org/），选择研究物种为“Homo sapiens”，最低相互作用评分设定为随机等置信度，数值为“confidence（0.990）”，并选择隐藏网络中断开连接的节点，其余参数保持默认设置，得到葶苈子、大枣作用于CHF的PPI（靶蛋白相互作用）网络。并通过Degree 值筛选出关键靶点。

1.7 GO 功能分析和KEGG 通路富集分析将药物-疾病交集基因导入DAVID 6.8数据库（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp），输入靶基因名称列表，设定其物种为“Homo sapiens”，进行基因本体论（gene ontology，GO）分类富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。

2 结果

2.1 葶苈子、大枣活性成分分析葶苈大枣泻肺汤由葶苈子和大枣2味中药组成，以OB≥30%，DL≥0.18为筛选条件，共获得活性成分42 个，对其进行分析，发现其中11 个活性成分没有靶点或无法搜索到其靶点。其余31 个活性成分包括谷固醇、山柰酚、细胞毒素、光千金藤碱、绣线菊碱A、香豆雌酚等。取其OB值前5位列出，见表1。

表1 葶苈大枣泻肺汤中OB值前5位活性成分

2.2 活性成分潜在靶点预测将31 个活性成分Canonical SMILES 码输入SwissTarget Prediction，删除重复项，得到556个预测药物靶点。

2.3 CHF 靶点从Gene Cards 数据库检索到8232个疾病靶点。

2.4 药物-疾病交集靶点将556 个化合物靶点与8232 个CHF 相关靶点基因进行映射，得到498个共同靶点基因。

2.5 构建中药活性成分-靶点网络将共同靶点基因及葶苈大枣泻肺汤有效活性成分利用Cytoscape 3.7.1 软件进行中药活性成分-靶点网络构建及分析，得出与共同靶点有联系的活性成分共23个，其中葶苈子8个，大枣13个，葶苈子、大枣共有活性成分2 个（quercetin、beta-sitosterol）。网络中有521个节点（其中中药活性成分节点23个，靶基因节点498个）和2834条边，由于图中包含节点及边数较多，难以完整直观体现，现选葶苈子及大枣共同化合物成分且Degree值位于第二的化学物进行中药活性成分-靶点网络展示（quercetin）。Degree 值较高的前5 位化合物中，最高为富马碱（Fumarine），其次为槲皮素（quercetin），山柰酚（kaempferol），二荷亚麻酸（Dihomo linolenic acid）和穆坪马兜铃酰胺（Moupinamide），这些活性成分可能是葶苈大枣泻肺汤发挥治疗CHF 的关键，见表2、图1。

表2 葶苈大枣泻肺汤关键活性成分基本信息

图1 中药活性成分-靶点网络图（quercetin）

2.6 PPI 网络构建及关键靶点筛选将映射得到的498 个交集靶点导入STRING 数据库进行PPI网络分析，基于confidence（0.990），网络中发生蛋白相互作用的靶点有132个，177条边代表了蛋白间的相互作用。将得出的PPI 网络数据导入Cytoscape 3.7.1 软件进行分析，根据Degree 值大小，推测葶苈子、大枣治疗冠心病与CKD1、AKT1、CCNB1、STAT3、CCNA2、CDC25C、PLK1、CKD2、CCNB2、CDC25A等靶基因关系较大，见图2—3。

图2 葶苈大枣泻肺汤关键靶点网络图

图3 葶苈大枣泻肺汤治疗慢性心衰靶蛋白PPI网络图

2.7 GO 功能分析498 个药物-疾病交集靶点作用了175 个生物学过程（P＜0.05），选取P值排名前20 的功能信息。结果显示，葶苈子、大枣活性成分主要富集在信号转导、蛋白质磷酸化、对药物的反应、凋亡过程负调控、细胞增殖正调控、炎症应答、蛋白质磷酸化、细胞增殖、肽基−酪氨酸磷酸化、肽基−丝氨酸磷酸化、ERK1和ERK2级联的正调控、血小板激活、细胞迁移的正调控、胞质钙离子浓度的正调控、配体受体信号通路、白细胞游走、对乙醇的应答、胆碱能突触传递、G 蛋白偶联受体信号通路（偶联到环核苷酸第二信使）、血管收缩的正向调节等生物活动过程中。结果显示，细胞成分（cellular constituent，CC）分析富集基因数量较大的有等离子体膜、胞体、质膜整体组分、核浆、细胞膜等；分子功能（molecular function，MF）分析富集基因数量较大的有蛋白结合、ATP 结合、蛋白激酶活性、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性等，见图4—6。

图4 葶苈大枣泻肺汤活性成分潜在靶点GO通路富集分析的BP分析

图5 葶苈大枣泻肺汤活性成分潜在靶点GO通路富集分析的CC分析

图6 葶苈大枣泻肺汤活性成分潜在靶点GO通路富集分析的MF分析

2.8 KEGG 通路富集分析通路富集分析发现，该489个靶点主要富集在121条通路上（P＜0.05），其中20 条通路与CHF密切相关，其中前20 条主要通路包括神经活性配体-受体相互作用、癌症通路、PI3K/Akt 信号通路、癌症中的蛋白多糖、cAMP信号通路、黏着斑、钙离子信号通路、胰岛素抵抗、血清能突触、前列腺癌、甲状腺激素信号通路、T细胞受体信号通路、孕酮−介导的卵母细胞成熟、HIF-1 信号通路、急性髓样白血病、胰腺癌、神经胶质瘤、催乳素信号通路、癌症的中心碳代谢、非小细胞肺癌，提示葶苈大枣泻肺汤可通过多条通路作用于CHF，见图7。

图7 葶苈大枣泻肺汤活性成分潜在靶点KEGG通路富集分析

3 讨论

本研究基于网络药理学方法，应用相关数据库及软件对葶苈大枣泻肺汤治疗CHF 的作用机制进行探讨。葶苈子、大枣共有42 种活性成分，共包括有556 个基因靶点，与CHF 的交集靶点有498个，进一步提炼分析出葶苈大枣泻肺汤治疗CHF的生物进程、细胞功能、分子功能，发现涉及信号转导、蛋白质磷酸化、对药物的反应、凋亡过程负调控、细胞增殖正调控、炎症应答、蛋白质磷酸化、细胞增殖、肽基−酪氨酸磷酸化、肽基−丝氨酸磷酸化、ERK1和ERK2级联的正调控、血小板激活、细胞迁移的正调控、胞质钙离子浓度的正调控、配体受体信号通路、白细胞游走、对乙醇的应答、胆碱能突触传递、G 蛋白偶联受体信号通路（偶联到环核苷酸第二信使）、血管收缩的正向调节等分子功能，这与CHF的发生发展有一定联系。

KEGG 通路富集分析发现20 条通路与CHF 发病显著相关。葶苈大枣泻肺汤可能作用于以下通路，从而对CHF的治疗发挥作用。

环腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）是普遍存在的第二信使，可维持线粒体稳态，调节线粒体动力学，并调节细胞应激反应和其他信号传导途径［10］。其对于心脏，cAMP 是心脏生理学及病理生理学的关键调控因子，其介导的信号转导复合物是肾上腺素能应激时心率、心脏收缩力和舒张力的重要调控因子之一，持续的激活cAMP通路，可能会导致心力衰竭进展［11］。

PI3K的活化和其下游的AKT是心脏保护作用重要信号传导途径。雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是AKT 的下游靶点，用雷帕霉素抑制mTOR 可预防心脏肥大，抑制心脏衰竭［12］。在心力衰竭中，AKT 的短期活化可有利于血管的形成、抑制细胞自噬、调节心肌能量代谢、调节钙离子通道、影响心肌炎症反应等，但长期的AKT 活化会导致心肌细胞功能损伤，因此，维持AKT的平衡尤为重要［13］。

胰岛素抵抗和心脏胰岛素代谢信号传导的相关减少正在成为心力衰竭发展的主要因素，导致心脏胰岛素抵抗发展的主要因素是氧化应激，高血糖，高脂血症，脂肪因子/细胞因子分泌失调和肾素-血管紧张素Ⅱ-醛固酮系统（RAAS）及交感神经系统的不适当激活［14］。PI3K/Akt 通路被认为在胰岛素效应中起重要作用［15］。在胰岛素抵抗和2 型糖尿病患者中，由于线粒体功能障碍导致的线粒体氧化磷酸化减少，抑制胰岛素诱导PI3K 活性，并导致胰岛素刺激后AKT2 活性降低，从而对心肌细胞产生不利影响［16］。

心肌细胞重塑和转换的途径，重点是Ca2+信号传导、自噬和细胞凋亡。Ca2+处理，通过自噬进行细胞内循环，以及通过细胞凋亡进行程序性细胞死亡，这些都是正常心脏功能所必需的［17］。Ca2+信号传导在心肌细胞中受到高度调节，并决定了心肌收缩的力量。Ca2+循环是指细胞内Ca2+的释放和再摄取，可驱动肌肉收缩和放松。在衰竭的心脏中，Ca2+循环被彻底改变，导致收缩性受损和致命的心律失常［18］。失败的心肌细胞的标志是改变的激发-收缩偶联，包括减少的Ca2+瞬变，以及那些瞬变的延迟发作和衰变。这些变化最终导致心肌收缩力减弱，收缩延迟，放松减缓［17］。

CHF 被认为是循环系统中T 细胞活化和炎性细胞因子产生增加的慢性炎症状态。有研究［19］将CHF 患者和健康对照组T 细胞和单核细胞中细胞因子的基因表达和表面活性标记物的表达进行对照，CHF 患者的T 细胞表面活化标志物CD69 和CD25 表达增加，认为T 细胞可能是慢性心衰炎症反应的一部分，预防不必要的T 细胞活化可能成为治疗CHF的新靶点。

甲状腺激素极大地影响心脏的能量稳态［20］。长期过量甲状腺激素暴露可能对心脏形态和功能产生不利影响，因为其可能增加左心室质量、动脉硬化和左心房大小，并可能诱发舒张功能障碍，从而影响左心室功能。而甲状腺功能减退症的特点是由于心率和脑卒中量的降低而导致的低心排血量。

由于舒张功能受损和血容量减少，心脏预负荷降低。虽然耗氧量减少，但其心脏能量效率却受到损害［21］。HIF-1 是一种转录因子，在所有动物物种中均作为氧稳态的主要调节剂［22］。疾病与HIF-1 可相互影响，循环系统将血液分配到每个组织，并输送氧气和营养。血液循环紊乱会减少氧气的输送，从而导致组织缺氧，这种缺氧发生在多种心血管疾病中，包括动脉粥样硬化，肺动脉高压和心力衰竭。尽管可由于心血管疾病而诱发组织缺氧，但缺氧信号本身具有调节组织重塑过程或心血管疾病严重性的能力。HIF-1 在心力衰竭（氧供需不匹配）情况下可被激活，可活化的肌细胞调控与氧供应、代谢、收缩特性有关的基因，在负荷诱导的心肌肥厚的形成和重构中发挥作用［23］。

本研究通过网络药理学分析及文献查阅，发现葶苈大枣泻肺汤有可能通过多条途径作用于CHF，且大部分作用通路均与CHF 有密切联系，但是由于现代对葶苈子、大枣的研究不多，因此其具体活性成分作用机制尚不明确，有待进一步研究。但可以确定葶苈大枣泻肺汤可通过多成分、多靶点、多通路治疗CHF，其具体机制需要开展相关研究进行验证。