苓桂术甘汤含药血清对TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞α-SMA和胶原蛋白合成的影响

葛瑞瑞，王 翔，汤同娟，王 靓，2，3，翟梦婷，左梦雨，陈 建，2，3，周 鹏，2，3，黄金玲，2，3

（1.安徽中医药大学中西医结合学院，安徽 合肥230012；2.安徽省中医药科学院中西医结合研究所，安徽 合肥230012；3.中药复方安徽省重点实验室，安徽合肥230012）

心肌纤维化（myocardial fibrosis，MF）是心肌梗死、心力衰竭等多种心血管疾病产生的病理改变，主要特征为胶原沉积的增多、排列的紊乱，Collagen I、CollagenⅢ比率的增加［1，2］，从而导致心室舒张功能的减退，以致诱导严重心律失常的发生，甚至出现心肌梗塞，引起猝死。因此，抑制心肌纤维化为治疗心血管疾病的方案之一［3，4］。

研究表明，复方中药具有多个靶点与多个途径的作用特点以及副作用小的药理作用，从而在心血管疾病的治疗中得到广泛的应用［5］。LGZGD出自汉代张仲景《伤寒杂病论》中的经典名方，具有温阳健脾、化饮利水之功效，组方严谨，配伍精当，被广泛应用于心血管疾病治疗的各种病症以及各个阶段，疗效显著［6，7］。课题组前期研究证实了该复方在前心衰阶段，能够有效抑制心梗后的心室重构，从而防治心衰的发展［8，9］。为探讨该复方在抗纤维化中的作用，本实验采用致纤维化因子TGF-β1诱导心肌成纤维细胞，观察LGZGD对CFB胶原蛋白的分泌、以及α-SMA和FN表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

Sprague-Dawley（SD）大鼠（雄性）18只，体质量200～220 g，新生健康SD乳鼠20只（1 d龄），均购自安徽医科大学实验动物中心，实验动物严格按照安徽中医药大学实验动物中心的伦理相关规定进行处置。

1.2 实验药物

苓桂术甘汤：茯苓、桂枝、白术、甘草（批号：1807181、2005181、2002202、1911141）均 购 自 安 徽普仁中药饮片有限公司。参考本课题组前期发表的文献［10］方法制备得到干燥粉末，再进行分装密封后，采取避光保存条件，备用。含药血清的制备［11］：将SD大鼠随机分为空白组和给药组。苓桂术甘汤的灌胃剂量为8.4 g/kg，2次/d，7 d，末次给药45 min后，腹主动脉取血，静置1 h，3 000 r/min离心10 min，提取血清，水浴30 min（56℃），滤膜过滤除菌，保存（—80℃），备用。

1.3 实验试剂

DMEM/F12培养基，胎牛血清均购自（美国，赛默飞）；胰酶消化液（上海，碧云天）；TGF-β1（北京，博奥森生物）；4%多聚甲醛，Triton X-100均购自（北京，索莱宝）；波形蛋白（上海，瑞齐生物）；DAPI染色液，α-SMA抗体，Collagen I抗体，CollagenⅢ抗体，FN抗体，FN的ELISA试剂盒均购自（上海，酶联生物）。

1.4 实验仪器

CO2细胞培养箱（美国，Thermo）；倒置荧光显微镜（日本，奥林巴斯株式会社）；电泳仪（美国，Bio-Rad）；凝胶成像系统（美国，Protein Simple）；酶联免疫工作站（意大利，Maroche）。

1.5 实验方法

1.5.1 细胞培养 取新生SD乳鼠1 d龄，无菌条件下取心室肌，剪碎，0.25%胰酶（0.5 mL/只），4℃过夜；12 h后，10%FBS的DMEM培养基（0.5 mL/只），水浴5 min（37℃）；弃液，胶原酶消化液（0.5 mL/只），水浴40 s（37℃）；将心脏置于有磁珠的含胶原酶消化液（0.6 mL/只）的血清瓶中，搅拌15 min（37℃）；留上清，1 000 r/min，5 min；留沉淀，加DMEM培养基（FBS+Brdu），放入培养箱中；静置90 min，成纤维细胞贴壁后，换液，即获得心肌成纤维细胞，培养至融合状态后按1∶2传代，用波形蛋白抗体进行免疫染色鉴定。

1.5.2 实验分组 将细胞分别以5×105个/mL、5×104个/mL的密度接种于6孔板及24孔板中，每孔的细胞悬液体积分别为2 mL、1 mL，置于37℃、5%CO2培养箱中。贴壁后，3%FBS的DMEM培养基继续培养24 h。设空白组、20%空白大鼠血清组、模型组和LGZGD含药血清组（5%、10%、20%），除空白组和空白大鼠血清组，每组加入TGF-β1（5 ng/mL），放入培养箱中培养24 h后进行药物干预。

1.5.3 检测指标及方法 免疫荧光法鉴定心肌成纤维细胞及检测α-SMA的表达：洗板：PBS，3 min/次，3次；固定：4%多聚甲醛，15 min；洗板：同上；孵育：0.5%Triton X-100，20 min（室温）；洗板：同上；封闭：10%正常羊血清，30 min；孵育：波形蛋白一抗（1∶200），4℃；次日，洗板：同上；孵育：荧光二抗（1∶200），1 h（室温）；洗板：同上；染色：DAPI染色液，5 min；封片；荧光显微镜拍照。

WB检测Collagen I、CollagenⅢ、α-SMA及FN的表达：收集处理后的CFB，弃培养液，用PBS洗孔板，裂解，离心，取上清液，蛋白定量，加4×上样缓冲液，加热使蛋白变性。转膜；封闭：2 h；洗膜；孵育：Collagen I、CollagenⅢ、α-SMA、FN抗体，4℃；次日，洗膜；孵育：羊抗兔IgG酶标抗体，2 h；洗膜；用化学发光试剂盒显影，Image J分析各蛋白条带的灰度值，并以β-actin为内参，实验重复3次。

ELISA检测Collagen I、CollagenⅢ及FN的表达：按照ELISA试剂盒说明书的步骤进行操作。

1.6 统计学处理

采用IBM SPSS Statics 23.0软件对数据进行分析。连续型变量采用“均数±标准差（±s）”进行统计学描述。多组均数比较即采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CFB的鉴定

CFB的形态独特，多呈梭形；其细胞核是卵圆形，细胞之间均匀排列，且密集以致于部分重叠并交叉。免疫荧光法鉴定CFB，以成纤维细胞的特征性标志Vimentin抗体为一抗［12］，其中环绕着细胞核的红色网状结构Vimentin表达为阳性，蓝色的部分为DAPI染核。随机计数5个视野，结果显示Vimentin阳性细胞的数量占细胞总数的95%以上，表明所获的细胞可用于后续实验，见图1。

图1 CFB细胞培养48 h后的形态（200×）Fig 1 The morphology of CFB cells after 48 h of culture（200×）

2.2 LGZGD含药血清对α-SMA表达的影响

与空白组比较，模型组α-SMA的表达增高；与模型组比较，5%、10%、20%LGZGD含药血清组的荧光强度依次降低，即表达减少，见图2。

2.3 LGZGD含药血清对Collagen I、CollagenⅢ、α-SMA及FN表达的影响

图2 免疫荧光法检测不同浓度LGZGD对TGF-β1诱导心肌成纤维细胞α-SMA的表达的影响（200×）Fig 2 Immunofluor escence method to detect the effect of differ ent concentrations of LGZGD on the expr ession ofα-SMA in cardiac fibroblasts induced by TGF-β1（200×）

与空白组比较，模型组Collagen I、CollagenⅢ、α-SMA及FN蛋白表达增加（P＜0.01）；与模型组比较，5%、10%、20%LGZGD含药血清组Collagen I、CollagenⅢ、α-SMA及FN蛋白表达减少，差异有统计学意义（P＜0.01）；且随着LGZGD含药血清浓度的增加而依次降低，见表1、图3。

表1 各组别蛋白WB检测结果（n=3，±s）Tab 1 WB detection results of protein in each group（n=3，±s）

表1 各组别蛋白WB检测结果（n=3，±s）Tab 1 WB detection results of protein in each group（n=3，±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01;与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

FN 0.467±0.003 0.415±0.009 0.993±0.004**0.603±0.016##0.563±0.009##0.437±0.016##组别空白组20%空白大鼠血清组模型组5%LGZGD含药血清组10%LGZGD含药血清组20%LGZGD含药血清组Collagen I 0.270±0.015 0.225±0.022 0.974±0.011**0.555±0.053##0.242±0.017##0.140±0.017##CollagenⅢ0.562±0.013 0.473±0.011 1.048±0.014**0.865±0.015##0.778±0.014##0.656±0.001##α-SMA 0.630±0.005 0.607±0.002 1.040±0.005**0.842±0.003##0.772±0.001##0.477±0.014##

图3 不同浓度LGZGD对TGF-β1诱导心肌成纤维细胞Collagen I、CollagenⅢ、α-SMA及FN的影响Fig 3 The effect of different concentrations of LGZGD on TGF-β1 induced myocardial fibroblasts Collagen I，CollagenⅢ，α-SMA and FN）

2.4 LGZGD含药血清对Collagen I、CollagenⅢ及FN表达的影响

与空白组比较，模型组Collagen I、CollagenⅢ及FN的表达增加（P＜0.01）；与模型组比较，5%、10%、20%LGZGD含药血清组Collagen I、CollagenⅢ及FN的表达减少，差异有统计学意义（P＜0.01），见表2、图4。

表2 各组别蛋白ELISA检测结果（n=3，±s）Tab 2 ELISA test results of protein in each group（n=3，±s）

表2 各组别蛋白ELISA检测结果（n=3，±s）Tab 2 ELISA test results of protein in each group（n=3，±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01;与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别空白组20%空白大鼠血清组模型组5%LGZGD含药血清组10%LGZGD含药血清组20%LGZGD含药血清组FN 12.362±0.822 10.824±0.714 46.987±0.931**28.057±0.998##22.837±1.137##17.554±0.607##Collagen I 18.623±2.295 13.289±1.696 41.516±2.146**30.384±1.890##22.415±2.329##13.780±2.329##CollagenⅢ29.068±1.693 23.022±0.878 127.837±2.677**102.848±3.680##61.617±4.984##29.874±2.913##

图4 不同浓度LGZGD对TGF-β1诱导心肌成纤维细胞Collagen I、CollagenⅢ、及FN的影响Fig 4 The effect of different concentrations of LGZGD on TGF-β1 induced myocardial fibroblasts Collagen I，CollagenⅢ，and FN

3 讨论

心肌纤维化的众多发生机制中血管紧张素水平的提高为主要原因，且能够促进纤维化的细胞因子中，TGF-β1可调节细胞的增殖与分化，刺激多种活性物质的合成与分泌，参与细胞外基质的构成与降解，以及加快纤维化的发展等作用［13-15］。细胞外基质（extracellular matrix，ECM）是一种分布在细胞表面或细胞之间的大分子，主要成分是Collagen I和CollagenⅢ。一方面，ECM保持心脏的结构与功能是通过维持细胞的形态并在细胞之间传递收缩力；另一方面，胶原蛋白的沉积、成分的改变及空间结构的紊乱能够导致心肌纤维化。因此，抑制CFB的增殖与分化，降低其合成胶原的能力对抑制心肌纤维化具有重要意义［16-18］。α-SMA是经典的肌成纤维细胞标志物，除了α-SMA以外还有FN，也常用于肌成纤维细胞的鉴定，在细胞膜上高度表达，可以与胶原蛋白、纤维蛋白、TGF-β1等多种成分结合［8，19-22］；从 而 维 持 细 胞 以 及 影 响 基 质 的 结 构 与功能［23］。

本研究采用5 ng/mL的TGF-β1刺激心肌成纤维细胞，在α-SMA的表达方面，其中WB结果表明，与空白组对比，模型组α-SMA的表达升高，与模型组比较，各浓度实验组的表达明显下降，有显著性差异，其中高浓度药物组表达的降低尤为明显；且α-SMA免疫荧光染色结果显示，在TGF-β1的作用下心肌成纤维细胞形态的变化如尺寸增大、肌丝扩增以及排列的密集等都十分明显，由此说明TGF-β1有效地诱导了成纤维细胞的转化，给予LGZGD含药血清干预后，荧光强度随着浓度的升高而减弱。在FN的表达方面，与空白组对比，模型组FN的表达增加，与模型组比较，各浓度实验组的表达明显下降，有显著性差异，其中高浓度药物实验组的表达的下降尤为明显。在胶原蛋白合成方面，与空白组对比，模型组Collagen I及CollagenⅢ蛋白合成增加，与模型组比较，Collagen I蛋白及CollagenⅢ的表达下降，有显著性差异，这说明LGZGD能够抑制胶原合成，提示LGZGD具有在一定程度上拮抗TGF-β1诱导的心肌纤维化作用，抑制心肌纤维化，从而发挥其保护心肌的作用。但是LGZGD并不能完全抑制TGF-β1诱导的CFB的胶原合成，这可能与心肌纤维化的发生和发展有多种因素有关［24，25］。综上所述，LGZGD对TGF-β1诱导的CFB的胶原合成、肌纤维化标志物α-SMA以及FN具有明显的抑制作用，以及抗纤维化作用。但是该方的具体机制仍然有待后续进一步研究，课题组接下来会采用网络药理学的方法预测LGZGD治疗心肌纤维化的有效成分和作用靶点，并采用体内外相结合的方法对预测的靶点进行下一步的验证。