地塞米松对骨关节炎细胞模型基质金属蛋白酶的抑制作用

陈光耀，陈嘉琪，姚传辉，徐 愿，罗 静，鄢泽然，陶庆文

（1.北京中医药大学，北京100029；2.中日友好医院中医风湿病科，免疫炎性疾病北京市重点实验室，北京100029）

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种以关节软骨退变、骨赘形成及软骨下骨硬化为特征的退行性病变［1］。研究表明OA与年龄、肥胖及关节创伤等一系列因素关系密切［2，3］。目前，越来越多证据表明炎症反应与骨关节炎的发生及长期存在有密切关系，尤其在OA早期，软骨细胞及滑膜细胞分泌的相关炎性细胞因子发挥了至关重要的作用［4，5］。软骨细胞在白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎性细胞因子的刺激下，通过PI3K/AKT、MAPK及NF-κB等途径刺激分泌OA相关的基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs），并进一步造成软骨基质降解是软骨退变发生的重要因素［6，7］。

SW1353细胞最初由美国模式培养物集存库（American type culture collection，ATCC）从一名原发软骨肉瘤患者肱骨处提取，该细胞系在保留了相关软骨细胞特性的同时能够无限增殖。研究表明，该细胞与人的软骨细胞均能够被炎性因子诱导产生MMPs，因此广泛用于OA相关研究［8］。地塞米松（DEX）属于甾体类抗炎药物，可抑制前列腺素等花生四烯酸代谢产物，同时促进黏多糖合成并抑制其降解酶从而发挥保护细胞间基质的作用，在临床中广泛用于自身免疫性炎症性疾病、过敏性疾病的治疗［9，10］。本研究拟通过地塞米松干预IL-1β致炎的SW1353 OA细胞模型，探究地塞米松潜在的软骨保护作用，为通过关节腔注射甾体抗炎药预防OA提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试剂

SW1353细胞（ATCC来源）购买于北京中科质检生物技术有限公司。其他试剂有：Leibovitiz′s L-15培养基（Gibco，美国），胎牛血清（ScienCell，美国），地塞米松（Sigma，美国），［3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-5-（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfo -phenyl）-2H-tetrazolium inner salt，MTS］（Promga，美国），IL-1β（Peprotech，美国），磷酸缓冲盐溶液（Hyclone，美国），MMP-1抗体（10371-2-AP，Proteintech,美国），MMP-3抗体（ab53015，Abcam，英国），MMP-13抗体（ab39012，Abcam，英国），小鼠抗β-actin抗体（TA-09，中杉金桥，中国），山羊抗小鼠IgG/辣根酶标记（ZB-5305，中杉金桥，中国），山羊抗兔IgG/辣根酶标记（ZB-2301，中杉金桥，中国），10%变性预制胶（普利莱，中国），膜封闭液（索莱宝，中国），一抗二抗稀释液（普利莱，中国），PVDF膜（Millipore，美国），ECL发光液（Millipore，美国），逆 转 录 试 剂 盒（A 3500，Promga，美 国），SYBR Green Realtime PCR Master Mix（QPK-201，TOYOBO，日本），Ripa裂解液（索莱宝，中国），PMSF（索莱宝，中国），HiPure Total RNA Mini Kit（美基公司，中国），MMP-1、MMP-3、MMP-13、β-actin引物（擎科生物科技），具体序列见表1。

表1 实时定量PCR引物序列Tab 1 Primer sequences of PCR

1.2 细胞培养

SW1353于含90%L-15培养基、10%胎牛血清、100μ/mL青霉素及100 mg/mL链霉素的完全培养基中培养，密闭瓶口放置于37℃孵箱中，待细胞长满培养瓶后使用胰酶将细胞消化后收集细胞。细胞增殖实验时将细胞种植于96孔板并设置4个副孔（每孔2万个细胞），PCR及Western Blot实验将细胞种植于6孔板中（每孔50万个细胞），给予不同浓度地塞米松和（或）10 ng/mL IL-1β进行干预，干预后使用封口膜封闭培养板。

1.2 MTS法检测地塞米松、IL-1β对SW1353细胞活性的影响

将收集到的未干预细胞加入完全培养基稀释成20万个细胞/mL，充分混匀后将96孔板每孔加入100μL含细胞培养基，分别加入地塞米松溶液使培养基中地塞米松最终浓度为101～108nmol/L，未加地塞米松溶液组别作为空白对照组，使用封口膜封闭96孔板于37℃孵箱中培养12 h，每孔加入20μL MTS，1 h后将96孔板置于酶标仪中检测490 nm波长下的光密度值。将空白对照组细胞活力设定为100%，并以此为基础计算其余各组细胞活力。104、106、107nmol/L地塞米松组加入或不加入10 ng/mL IL-1β，计算各组细胞活力并与空白对照组比较。

1.3 实时定量PCR法检测MMP-1、MMP-3、MMP-13的mRNA表达

将收集到的细胞加入完全培养基稀释成25万个细胞/mL，充分混匀后6孔板每孔加入2 mL含细胞培养基。取不做特殊处理的组别作为空白对照组，其余各组均加入10 ng/mL IL-1β。IL-1β组不加地塞米松，其余各组分别加入地塞米松，使溶液中 地 塞 米 松 最 终 浓 度 分 别 为101、102、103、104、105、106、107nmol/L，使用封口膜封闭6孔板于37℃孵箱中培养12 h，采用HiPure Total RNA Mini Kit试剂盒进行柱式法提取总RN，并进一步将1μg总RNA逆转录形成cDNA，将SYBR Green Realtime PCR Master Mix、cDNA及引物配置成20μL反应体 系，以β-actin作 为 内 参 检 测MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA相对表达量。

1.4 Western Blot法 检 测MMP-1、MMP-3、MMP-13蛋白表达

实验分组及干预方法同PCR实验，干预结束后将1%PMSF加入Ripa裂解液中，弃去培养基后每孔加入Ripa裂解液250μL于冰上裂解25 min，10 000 r/min离心5 min取上清液。将上清液与上样缓冲液以4∶1的比例进行混合，煮沸后离心10 000 r/min离心5 min，取上清液上样。使用10%变性预制胶及自带Hepes电泳缓冲液进行电泳，使用70 v电压进行60 min转膜至PVDF膜上，膜封闭液进行封闭1 h后，加入相应稀释后的一抗（MMP-1 1∶5 000、MMP-3 1∶1 000、MMP-13 1∶1 000、β-actin 1∶1 000）后4℃进行过夜，使用TBST进行清洗后加入相应的稀释后的山羊抗小鼠（兔）IgG/辣根酶标记二抗（1∶5 000）孵育1 h，使用TBST清洗后滴加ECL发光液后进行曝光。

1.5 统计学处理

采用IBM SPSS Statistics 25.0对数据进行统计分析，计量资料用（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验；不同浓度地塞米松组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用Dunnett法；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTS法检测地塞米松对SW1353细胞的抑制作用

MTS增殖实验结果提示101～107nmol/L地塞米松对细胞活性无明显影响，108nmol/L地塞米松对细胞具有明显的抑制作用（图1、表2）；在0、104、106、107nmol/L不同浓度地塞米松干预下，加入或不加入10 ng/mL IL-1β对其细胞活性未见明显影响（图2、表3）。因此，本研究选择地塞米松浓度为101～107nmol/L作为后续实验工作浓度。

2.2 PCR法 检 测MMP-1、MMP-3、MMP-13的mRNA表达

当SW1353细胞加入10 ng/mL的IL-1β后，MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA的表达水平明显升高（6～14倍）。PCR结果提示使用不同浓度的地塞米松干预IL-1β诱导的SW1353细胞后，MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA的表达水平有所降低，并呈现出一定的剂量依赖效应。如图3、表4所示，加入102～107nmol/L地塞米松进行干预后，MMP-1的mRNA表达水平明显降低，和仅加入IL-1β组相比差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；104～107nmol/L地塞米松干预后，MMP-3的mRNA表达明显减少，和仅加入IL-1β组相比差异有统计学意义（P均＜0.01）；101～107nmol/L地塞米松干预后，MMP-13的mRNA表达明显减少，和仅加入IL-1β组相比差异均有统计学意义（P均＜0.01）。加入104nmol/L地塞米松组与加入103nmol/L地塞米松组相比，MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA表达水平明显降低，推测该浓度的地塞米松可能是适宜于 干预IL-1β诱导的SW1353细胞的最适宜浓度。

图1 不同浓度地塞米松干预SW1353细胞12 h后细胞活力Fig 1 Cell viability of SW 1353 cells 12 h after treatment of dexamethasone at different concentrations

图2 加入或不加入IL-1β不同浓度地塞米松培养SW1353细胞12 h细胞活力Fig 2 Cell viability of SW1353 cells 12 h after treatment of dexamethasone with or without IL-1β

表2 101～108 nmol/L地塞米松培养SW1353细胞12 h后细胞活力（±s）Tab 2 Cell viability of SW1353 cells 12 h after treatment of 101～108 nmol/L dexamethasone（±s）

表2 101～108 nmol/L地塞米松培养SW1353细胞12 h后细胞活力（±s）Tab 2 Cell viability of SW1353 cells 12 h after treatment of 101～108 nmol/L dexamethasone（±s）

注：q：Dunnett检验统计量。#不同浓度地塞米松（DEX）组分别与空白对照组比较。

指标细胞活力q P#空白对照组100.00±9.29 101 DEX 102 DEX 103 DEX 104 DEX 105 DEX 106 DEX 107 DEX 108 DEX 69.18±10.04 4.49 0.001--101.21±10.48 0.18 1.000 101.93±13.81 0.28 1.000 101.88±12.98 0.27 1.000 101.80±4.06 0.26 1.000 98.40±5.27 0.23 1.000 100.96±7.76 0.14 1.000 99.16±9.48 0.12 1.000

表3 加入或不加入IL-1β不同浓度地塞米松（101～107 nmol/L）培养SW1353细胞12 h细胞活力（±s）Tab 3 Cell viability of SW1353 cells 12 h after treatment of 101～107 nmol/L dexamethasone with or without 10 ng/m L IL-1β（±s）

表3 加入或不加入IL-1β不同浓度地塞米松（101～107 nmol/L）培养SW1353细胞12 h细胞活力（±s）Tab 3 Cell viability of SW1353 cells 12 h after treatment of 101～107 nmol/L dexamethasone with or without 10 ng/m L IL-1β（±s）

注：△加入10 ng/m L IL-1β干预，q：Dunnett检验统计量，#不同浓度地塞米松（DEX）组分别与空白对照组比较。

指标空白对照组IL-1β组104 DEX 104△DEX 106 DEX 106△DEX 107 DEX 107△DEX细胞活力100.00±9.29 101.86±7.36 101.80±4.06 97.3±12.88 99.16±9.48 103.34±6.73 69.18±10.04 68.62±3.37 5.26 0.000 q P#--0.31 1.000 0.30 1.000 0.45 0.997 0.14 1.000 0.56 0.991 5.16 0.000

图3 101～107 nmol/L地塞米松干预IL-1β诱导后的SW1353细胞MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA表达水平（n=3）Fig 3 Expression level of MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA of SW1353 cells treated with 101-107 nmol/L dexamethasone and 10 ng/m L IL-1β（n=3）

表4 101～107nmol/L地塞米松溶液干预IL-1β刺激后的SW1353细胞MMP-1、MMP-3、MMP-13mRNA表达（±s）Tab4 ExpressionlevelofMMP-1、MMP-3、MMP-13mRNAof10ng/mLIL-1βinducedSW1353cellstreatedwith101-107nmol/L dexamethasone（±s）

表4 101～107nmol/L地塞米松溶液干预IL-1β刺激后的SW1353细胞MMP-1、MMP-3、MMP-13mRNA表达（±s）Tab4 ExpressionlevelofMMP-1、MMP-3、MMP-13mRNAof10ng/mLIL-1βinducedSW1353cellstreatedwith101-107nmol/L dexamethasone（±s）

注：*q为Dunnett检验统计量，☆白介素-1β（IL-1β）组与空白对照组采用t检验。#不同浓度地塞米松（DEX）组分别与IL-1β组进行比较。

指标MMP-1mRNA q P#¯MMP-3mRNA q P#MMP-13mRNA q P#107DEX 1.70±0.35 13.42 0.000 4.20±0.57 11.08 0.000 1.18±0.14 18.10 0.000空白对照组1.00±0.00--1.00±0.00--1.00±0.00--IL-1β组7.28±0.79 13.79☆0.005 12.63±0.89 22.75☆0.002 13.10±1.53 13.70☆0.005 101DEX 6.62±0.72 1.57 0.486 11.25±1.23 1.81 0.347 9.57±1.12 5.35 0.000 102DEX 5.69±0.62 3.82 0.008 12.26±1.34 0.49 0.996 9.16±1.07 5.98 0.000 103DEX 4.99±0.54 5.51 0.000 10.77±1.18 2.45 0.122 6.26±0.62 10.38 0.000 104DEX 2.19±0.24 12.22 0.000 6.25±0.69 8.37 0.000 1.84±0.22 17.09 0.000 105DEX 1.96±0.21 12.79 0.000 5.78±0.63 9.00 0.000 1.63±0.14 17.41 0.000 106DEX 1.80±0.20 13.16 0.000 4.57±0.50 10.59 0.000 1.55±0.08 17.53 0.000

2.3 Westernblot法 检 测MMP-1、MMP-3、MMP-13的蛋白表达水平

Westernblot结果显示，相对于空白对照组，使用10ng/mLIL-1β刺激后，SW1353细胞MMP-1、MMP-3、MMP-1水平明显增高；使用104nmol/L的地塞米松干预后，和仅添加IL-1β组SW1353细胞比，MMP-1、MMP-3、MMP-1蛋白表达水平明显降低。见表5，图4、5。

表5 104nmol/L地塞米松溶干预IL-1β刺激后的SW1353细胞后MMP-1、MMP-3、MMP-1蛋白表达westernblot灰度值（±s）Tab5 GreyvalueofMMP-1，MMP-3，MMP-13proteinof IL-1βinducedSW1353cellstreatedwith104nmol/Ldexamethasone（±s）

表5 104nmol/L地塞米松溶干预IL-1β刺激后的SW1353细胞后MMP-1、MMP-3、MMP-1蛋白表达westernblot灰度值（±s）Tab5 GreyvalueofMMP-1，MMP-3，MMP-13proteinof IL-1βinducedSW1353cellstreatedwith104nmol/Ldexamethasone（±s）

注：#白介素-1β（IL-1β）组和空白对照组比较，DEX（地塞米松）组和IL-1β组比较。

指标MMP-1蛋白t P#MMP-3蛋白t P#MMP-13蛋白t P#空白对照组1.00±0.00--104DEX 3.533±0.57 2.92 0.043 1.24±0.07 8.91 0.001 1.50±0.21 3.98 0.016 1.00±0.00--1.00±0.00--IL-1β组5.267±0.86 8.62 0.013 2.74±0.28 10.62 0.009 2.94±0.59 5.68 0.030

图4 104nmol/L的地塞米松干预IL-1β诱导SW1353细胞后MMP-1、MMP-3、MMP-13蛋白表达水平Fig4 ExpressionlevelofMMP-1、MMP-3、MMP-13proteinsofSW1353cellstreatedwith104nmol/LdexamethasoneandIL-1β

图5 104nmol/L地塞米松溶干预IL-1β诱导SW1353细胞后MMP-1、MMP-3、MMP-13蛋白表达westernblot灰度值Fig5 GreyvalueofMMP-1，MMP-3，MMP-13proteinofIL-1βinducedSW1353cellstreatedwith104nmol/Ldexamethasone

3 讨论

活细胞中产生的还原型辅酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）及烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸，能够将MTS还原为有色的甲臢，通过检测其在490 nm的背景吸光度值可间接反映出活细胞数量［11］。本研究通过MTS实验发现，101～107nmol/L地塞米松对SW1353细胞活性未见明显的影响，当地塞米松浓度增加到108nmol/L后细胞活性明显被抑制，故本研究将地塞米松实验浓度设定在101～107nmol/L。

细胞外基质与细胞之间存在相互作用并对组织结构进行支持，因此在机体生理过程中发挥重要作用［12，13］。软骨由少量软骨细胞及大量细胞外基质构成，在相关蛋白酶的催化作用下，细胞外基质平衡被打破导致软骨被降解是OA发生的关键因素［14，15］。MMPs依赖Ca2+、Zn2+等金属离子作为辅助因子进行活化，与细胞外基质降解有密切关联，其中胶原酶MMP-1、MMP-13及基质溶解素酶MMP-3与OA关系最为密切［16-18］。本研究表明SW1353细 胞 被IL-1β诱 导 后，MMP-1、MMP-3、MMP-13在mRNA及蛋白表达水平均明显上升，与之前研究结果一致。

在使用不同浓度地塞米松进行干预后发现，较低浓度的地塞米松（MMP-13 10 nmol/L、MMP-1 100 nmol/L、MMP-3 1 000 nmol/L）即可对MMP具有一定的抑制作用，且具有明显的剂量-效应关系。其中使用104nmol/L地塞米松进行干预后，MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA的 表 达 量 较10、102、103nmol/L地塞米松干预后明显降低，结合105～107nmol/L地塞米松实验结果推测在本实验中104nmol/L浓度的地塞米松可能是达到较大抑制MMPs mRNA表达效果的最小剂量。进一步使用104nmol/L浓度的地塞米松对MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA蛋白水平的干预作用进行探究，Western blot实验结果提示，该浓度的地塞米松可以明显抑制MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA在蛋白水平的表达。

关节外伤及类风湿关节炎患者滑膜等组织产生IL-1β、TNF-α等炎性细胞因子［19，20］，进入关节腔后可以诱导软骨细胞产生MMP-1、MMP-3、MMP-13，从而导致软骨基质平衡破坏，进而造成OA的发生。本研究结果提示，小剂量的地塞米松即可延缓这些炎症反应的发生。推测在炎症反应初期进行小剂量的甾体抗炎药注射或可有效阻止OA的进展，但需动物实验及临床研究进一步验证。

本试验通过IL-1β致炎SW1353细胞制造OA细胞模型，并使用PCR、Western Blot方法检测地塞米松干预造模细胞后基质金属蛋白酶的变化，探索了地塞米松潜在的软骨保护作用。本文未对与骨关节炎相关的其他细胞因子进行检测，也未能更进一步地通过通路探索地塞米松抑制MMPs的具体机制。